胆汁酸稳态对机体保持正常生理功能起着重要的作用。胆汁淤积（Cholestasis）是指由各种原因造成肝内胆汁形成、分泌和排泄障碍,导致胆汁不能正常流入十二指肠从而反流入血液循环中的病理状态。胆汁淤积可引起黄疸、皮肤瘙痒、高胆固醇血症,如果得不到及时有效的治疗,会加重病情发展为肝纤维化、肝硬化,最终导致肝衰竭。法尼醇X受体（Farnesoid X Receptor,FXR）是胆汁酸的内源性配体,参与调控胆汁酸的生物合成、转运及代谢,对于维持胆汁酸的内环境稳态、缓解胆汁淤积具有重要意义,是治疗胆汁淤积及其它肝病的重要靶点。波棱瓜子又名赛季美朵、塞美塞古,是葫芦科波棱瓜属一年生藤本植物波棱瓜（Herpetospermum caudigerum）成熟干燥种子。波棱瓜生长于海拔2300-3500 m地域,主要分布于中国四川、西藏等地及印度、尼泊尔等国。波棱瓜子味苦性寒,具有泻肝火胆热,解毒的功效,在藏医临床用于治疗“赤巴病”,疗效确切。“赤巴病”与肝内胆汁淤积部分临床症状相似。课题组前期研究发现波棱瓜子提取物对由α-萘异硫氰酸酯（α-naphthylisothiocyanate,ANIT）诱导的SD大鼠急性肝内胆汁淤积具有显著治疗作用,但其活性物质、作用机制尚不明确。因此,本课题对波棱瓜子有效部位及有效成分进行抗肝内胆汁淤积的药效学研究,并基于FXR信号通路探讨其可能的作用机制。研究内容包括以下4个部分。1.波棱瓜子乙酸乙酯提取物（HPEAE）抗ANIT诱导的大鼠胆汁淤积的作用机制研究。以ANIT（60 mg/kg）诱导SD大鼠急性胆汁淤积动物模型,分别灌胃给予HPEAE（低、中、高剂量分别为100、200和400 mg/kg）和UDCA（100 mg/kg）,连续7 d。在课题组前期体内药效学研究结果（HPEAE能显著恢复肝功能指标水平,增加胆汁流量,逆转肝脏组织病理损伤程度及抑制炎症因子表达）证明HPEAE具有抗胆汁淤积作用基础上,进一步发现,HPEAE可上调肝脏组织中FXR、胆盐输出泵（BSEP）、多药耐药相关蛋白2（MRP2）、Na+/牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）及氧化应激Keap1/Nrf2信号通路中正核因子-E2相关因子2（Nrf2）、醌氧化还原酶1（NQO1）、血红素加氧酶1（HO-I）和炎症NF-κB信号通路中人核因子κB抑制蛋白（IκB）蛋白表达,下调Keap1/Nrf2信号通路中Keap1和NF-κB信号通路中P糖蛋白（P65）、磷酸化-P糖蛋白（P-P65）和NF-κB激酶α抑制剂（IKKα）蛋白表达。结果表明,HPEAE可能通过激活FXR信号通路促进胆汁酸转运,激活Keap1/Nrf2信号通路减轻氧化应激胁迫,抑制NF-κB信号通路抑制炎症因子释放,从而减轻胆汁淤积造成的肝损伤。2.体外抗胆汁淤积活性成分筛选。（1）为进一步发现波棱瓜子抗胆汁淤积活性成分,本研究对课题组其他成员从HPEAE中分离到的15个单体化合物进行了FXR激活作用筛选。以固甾酮（50μmol/L）处理L-02细胞抑制FXR表达,再以100μmol/L的化合物分别处理L-02细胞24 h后,利用高内涵细胞分析方法检测FXR表达情况。结果表明,波棱醇、spathulatd、落叶松内酯、去氢双松伯醇（DA）和波棱甲素（HPE）这5个化合物可显著上调L-02细胞中固甾酮抑制的FXR蛋白表达水平,表现出较好的FXR激动作用。我们推测木脂素可能是波棱瓜子抗胆汁淤积的主要活性成分。（2）利用Sybyl-X软件将15个化合物分别对接到FXR蛋白的活性位点,其中活性成分DA和HPE与FXR受体的对接打分介于激动剂GW4064之间,与FXR受体具有良好的结合作用,且与GW4064类似。进一步利用Autodock软件模拟DA和HPE与FXR的相互作用。结果表明,DA和HPE均能够结合在FXR蛋白的活性位点,且结合模式及作用方式与GW4064类似。DA、HPE与FXR受体的对接打分分别为-6.51、-6.80 kcal/mol（对照GW4064打分-8.57 kcal/mol）。氢键和疏水作用是DA和HPE与FXR蛋白识别的主要驱动力,由于HPE的分子结构比DA更大,占据了活性位点更大的空间,与周围氨基酸具有更强的疏水作用。HPE的对接打分比DA略高,这可能是由于HPE的结合构象与GW4064重叠部分较大;另外HPE的疏水作用力比DA较强,也是FXR与化合物识别的关键驱动。因此,拟选择DA和HPE进行后续研究。3.DA和HPE抗ANIT诱导的大鼠胆汁淤积保护作用研究。分别选取48只SD雄性大鼠随机分为6组:空白对照组（Control）、模型组（ANIT,60 mg/kg）、阳性药物组（UDCA,100 mg/kg）、药物低、中、高剂量组（DA和HPE的低、中、高剂量组均为10、20、40 mg/kg）,以ANIT诱导大鼠胆汁淤积模型后,连续给药7 d,空白组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠。结果表明,DA和HPE均可显著降低ANIT诱导的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和总胆汁酸（TBA）等肝功能指标表达的升高,促进胆汁流量分泌,逆转肝脏组织病理学损伤,以及逆转促炎因子肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）的升高,抗炎因子白细胞介素10（IL-10）的降低等炎症相关因子的表达。综上结果表明,DA和HPE均能显著逆转ANIT引起的大鼠肝内胆汁淤积,是波棱瓜子发挥疏肝利胆和保护胆汁淤积引起的肝损伤的活性成分,其中DA活性较HPE强。4.DA和HPE基于FXR信号通路抗胆汁淤积作用机制研究。（1）体内实验:为进一步研究DA和HPE抗胆汁淤积可能的作用机制。利用前述研究保存的肝脏组织,采用Western blot方法测定肝脏组织中相关蛋白的表达。结果表明DA和HPE均能上调FXR、小异源二聚体伴侣分子1和2（SHP1和SHP2）、BSEP、MRP2和NTCP的蛋白表达,下调胆固醇7α-hydroxylase（CYP7A1）和胆固醇27α-hydroxylase（CYP27A1）的蛋白表达。表明DA和HPE可能通过激动FXR受体,进而调控其下游靶蛋白的表达来抑制胆汁酸的合成,促进胆汁酸的转运减轻胆汁淤积。（2）体外实验:为进一步研究DA和HPE是否是通过激活FXR,发挥抗胆汁淤积作用,本研究利用人正常L-02细胞进行体外作用机制研究。（1）在正常L-02细胞中加入不同浓度的DA和HPE（均分别为6.25、12.5、25、50、100、200、400和800μmol/L）,采用MTT法考察DA和HPE对L-02细胞的安全性。结果表明DA和HPE对L-02细胞无明显抑制作用,并且在100μmol/L剂量对正常细胞不会造成显著损伤。（2）以50μmol/L固甾酮与L-02细胞共培养,干预FXR表达后,分别加入激动剂GW4064（6μmol/L）、DA和HPE（低、中、高剂量分别为25、50和100μmol/L）共培养24 h。采用RT-PCR技术和Western blot方法检测FXR、SHP1/2、CYP7A1、CYP27A1、BSEP、MRP2和NTCP的m RNA和蛋白表达水平。结果表明,给予药物DA和HPE后,细胞中FXR、SHP1、SHP2、BESP、MRP2和NTCP的表达显著上调,CYP7A1和CYP27A1的表达显著下调,且呈剂量依赖性。（3）为了证明DA和HPE对FXR靶点的作用,构建带有荧光标签的Si-FXR片段（20μmol/L）转染到L-02细胞中干扰FXR的表达。在Si-FXR转染L-02细胞48 h后分别加入DA和HPE（25、50和100μmol/L）,24 h后测定。结果表明,DA和HPE显著逆转了Si-FXR导致的FXR、SHP、BESP、MRP2和NTCP基因及蛋白表达的降低,CYP7A1和CYP27A1的基因及蛋白表达的增加。DA和HPE与阳性对照GW4064的作用相似,具有FXR激动作用,且100μmol/L DA和HPE对FXR及其下游相关蛋白的调控作用优于GW4064。（4）为进一步证明DA和HPE对FXR的激动作用,将带有荧光标签的FXR过表达质粒（1μg/μL）转染L0-2细胞,同样采用荧光观察、RT-PCR技术及Western blot方法发现过表达质粒对转染效果进行评价。在过表达质粒转染L-02细胞48 h后分别加入DA和HPE（25、50和100μmol/L）处理24 h,对细胞中FXR及其调控的下游靶基因和蛋白的表达进行测定。结果发现DA和HPE与GW4064作用相似,细胞中FXR、SHP、BESP、MRP2和NTCP基因及蛋白表达水平显著升高,CYP7A1和CYP27A1基因及蛋白表达显著降低,并且DA和HPE在100μmol/L剂量下对FXR及其下游相关基因和蛋白的调控作用比GW4064强。DA和HPE可作为FXR激动剂也得到了进一步证实。综上,本研究证明波棱瓜子有效部位HPEAE抗肝内胆汁淤积的作用可能是通过激活FXR信号通路促进胆汁酸转运,激活Keap1/Nrf2信号通路减轻氧化应激胁迫,抑制NF-κB信号通路抑制炎症因子释放,从而减轻胆汁淤积造成的肝损伤。通过高内涵体外活性筛选和分子对接技术筛选到两个具有显著FXR激动作用的木脂素DA和HPE,可能是波棱瓜子重要的活性成分;体内药效学研究表明,2个化合物对ANIT诱导的胆汁淤积大鼠肝损伤均具有显著的保护作用,DA活性较强;通过体外干扰和过表达FXR结合体内研究表明,它们可通过激活FXR,进而调节其下游信号通路,抑制胆汁酸的生物合成、促进胆汁酸的转运来调控胆汁酸的内稳态,减缓胆汁淤积性肝损伤。本研究阐明了波棱瓜子有效成分通过激活FXR靶点,调节下游基因表达,治疗“赤巴病”的药效及作用机制,为波棱瓜子的现代化开发利用,及基于FXR靶点开发创新药物奠定了基础。