醛类物质大多具有浓郁的香气而作为香精香料应用于食品、日化等领域,并且因为其化学活泼性而作为有机合成中重要的砌块,广泛地应用于医药合成中。然而,醛类物质的选择性化学合成却存在诸多限制。羧酸还原酶通过辅因子ATP和NADPH的作用,可选择性地将自然界中储量丰富的有机酸选择性转化为相应的醛,就为其合成提供了有潜力的生物催化方案。然而,天然的羧酸还原酶很难满足工业应用状况下的需求,主要表现为催化活力较低。同样,酰胺键也广泛存在于活性药物中间体中,酰胺形成反应也是药物合成中公认的重点研究领域。化学法合成酰胺多在极端pH及高温等苛刻条件下进行,且产率较低,严重违反了绿色化学原则。腈水合酶虽可水解腈类高原子经济性地产生酰胺类化合物,但该酶的一些固有缺陷（激活因子和金属离子依赖性、稳定性差、底物谱较窄等）限制了其应用。与之不同,腈水解酶在催化羧酸的过程中表现出重组表达容易、稳定性好、底物谱广的优势,且随着研究范围的扩大,发现部分腈水解酶产生酰胺副产物（次级活性）,如果可以人为调控腈水解酶主副反应的开关,即提高其次级活性,就为酰胺的合成提供了一种可持续地生物催化途径。酶分子的蛋白质工程改造为他们催化效率低的问题提供了解决方案。羧酸还原酶是一种由腺苷化结构域、还原结构域以及PCP结构域构成的酶分子机器,每个结构域中发生的反应都会对其催化效率造成限制,同时也为其工程化改造提供了靶点。在本研究中选择其功能更加重要的腺苷化结构域和还原结构域进行改造以提高其催化效率。腈水解酶在以其次级活性催化腈类水解产生酰胺化合物时,表现出了反应选择性和催化效率的拮抗（trade-off）,限制了其在酰胺生产中的应用,因此必须提高腈水解酶次级活性的催化效率。本研究围绕酶分子催化效率的理性设计,以羧酸还原酶和腈水解酶为对象展开,主要内容如下:第一,利用基因组挖掘技术,从实验室菌种库中保存的Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium neoaurum以及Mycobacterium fortuitum等菌种的基因组上获取羧酸还原酶编码基因,通过与磷酸泛酰乙胺转移酶的共表达,在Escherichia coli中成功实现了 6个羧酸还原酶的活性可溶表达。并结合前人报道选择对香草酸活性最高的羧酸还原酶MsCAR通过定点突变的方法对其关键氨基酸进行鉴定,发现该酶还原结构域与短链脱氢/还原酶高度类似的催化机理并推断了其腺苷化结构域“底物结合-腺苷化-硫酯化-中间体转位”的完整催化循环过程,为后续的理性设计奠定了基础。第二,羧酸还原酶腺苷化结构域催化效率的理性提高。开发了基于探针数据库的铰链区虚拟突变改造策略,成功解除了腺苷化结构域的ATP供应限制,提高了羧酸还原酶的催化效率。首先通过结构与序列分析构建小型探针突变库,获得了催化效率提高6.57倍的突变株R505I/N506K;结合分子动力学模拟方法解释了该突变株催化效率提高的机制,并找到了可便捷指示突变株催化效率的关键距离d1;随后利用d1的变化结合虚拟饱和突变方法对该区域进行活性筛选,最终得到了催化效率提高8.26倍的突变株R505F/N506G。该研究为羧酸还原酶及多结构域酶分子的理性设计提供了重要参考。第三,羧酸还原酶还原结构域催化效率的理性提高。与典型短链脱氢/还原酶催化的底物不同,羧酸还原酶还原结构域催化的底物具有位阻较大的磷酸泛酰乙胺修饰,这就对底物通道和活性口袋提出了更高的要求。分析该结构域的空间结构,选择其中对底物结合可能存在限制的底物通道入口和活性中心的丝氨酸-天冬氨酸-甲硫氨酸（SDM）结构基元进行改造研究,获得了催化活力达到野生型酶1.6倍的底物通道突变株Y946A和催化活力达到野生型酶2.4倍的活性口袋突变株D978S。该研究说明羧酸还原酶还原结构域的底物通道和活性口袋确实是提高其催化效率的有效靶点。第四,腈水解酶次级活性催化效率的理性提高。实验室前期研究中发现腈水解酶反应选择性和催化效率之间的拮抗导致了其酰胺生产效率受限。采用序列保守性分析、活性口袋空间位阻分析及稳定性增强分析三种手段对Nit-6803进行突变研究,发现增强腈水解酶稳定性的改造对缓解这种拮抗最为有效,并获得了酰胺合成效率大幅提高的突变株F193N/G101K。为推动腈水解酶催化酰胺类分子形成反应的工业化应用,本研究又对文献报道中稳定性较强的腈水解酶Nit-72W进行次级活性提升改造。选择其W188位点突变为极性较低、侧链较小的氨基酸残基,通过对底物2-氰基吡啶的活性筛选,得到了最佳突变株W188M,它能在12 h内完全转化250 mM的底物,产物中2-吡啶甲酰胺的比例大于98%,具有工业应用潜力。本研究不仅证明了提高酶分子稳定性是缓解腈水解酶次级活性和催化效率间拮抗的有效方案,还为酰胺类分子的生物合成提供了候选酶分子工具。