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研究背景肺癌是我国乃至全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。其传统的诊断、治疗及预后预测主要基于TNM分期、病理类型、分化程度和有无微血管侵犯等[2,3]。肿瘤出芽（tumor budding,TB）作为位于肿瘤边缘一种典型的病理现象,自1950年Imai提出TB这一概念以来[4],越来越受到研究人员的关注。TB是包括肺癌在内的多种癌症不良预后因素,反映了肿瘤的侵袭行为。近年来,人们逐渐发现免疫微环境与肿瘤的侵袭性也存在重要关系,肿瘤微环境中的免疫抑制状态可促进癌症进程。更有趣的是,人们发现在TB区域存在大量被抑制的免疫细胞。然而,到目前为止,TB在肺癌中的预后及预测意义以及其与免疫微环境的内在联系尚不完全清晰,有待进一步研究。研究目的本研究旨在探讨肺癌TB对预后的影响及其与免疫微环境的关系。1.探究肺癌患者的TB对预后及预测的影响,探究TB结合传统TNM分期系统对肺癌患者的预后预测情况,为肺癌患者预后的预测指标提供补充。2.探究TB与T细胞为主的免疫微环境相关性,寻找两者在肺癌肿瘤边缘的内在联系,深入探究TB结合免疫微环境状态对肺癌患者预后预测情况。研究方法:本研究回顾性分析了 2009年1月1日至6月31日在上海肺科医院接受手术的肺癌患者,对纳入的患者预后情况进行为期10年的随访,根据第7版肺癌TNM系统对肿瘤分期进行分类。共计178例患者的肿瘤切片可供组织学评估,纳入本研究。其中,N0期患者119例,N1、N2期患者59例。本研究的纳入标准如下:（1）经病理证实的原发肺癌;（2）术前未接受任何系统治疗的患者。本研究采用免疫组织化学（Immunohistochemical,IHC）染色法对肺癌组织的细胞角蛋白（Cytokeratin,CK）进行染色,用以标记TB状态。TB是指在肿瘤组织边缘间质中存在的孤立肿瘤细胞巢,一般由＜5个肿瘤细胞组成。在200倍显微视野下进行病理切片的出芽计数,按照统计出芽的数量分为0级（无出芽结构）,1级（＜5个出芽结构）,2级（5个或＞5个出芽结构）。其中,将0级与1级TB分级定义为低级别TB,2级TB定义为高级别TB。此外,采用免疫组化法,染色标记肺癌组织中位于T细胞膜表面的 TIM-3（T cell immunoglobulin and mucin domain containing-3）和 PD-1（programmed cell death 1）表达,以及CD8+的肿瘤浸润淋巴细胞（CD8+ tumor infiltratinglymphocytes,TILs）的密度。上述用以分析TB与免疫微环境标志物之间的相关性。本研究以ROC分析来确定各标记物阳性表达的最佳截止值。我们将TIM-3阳性定义为不区分细胞（肿瘤细胞或TILs）的标记物表达阳性。另外,PD-1阳性被定义为≥8%细胞着色面积。CD8+TILs阳性被定义为有核细胞中着色面积≥25%。研究中,采用Spearman秩相关法分析TB与TILs、TIM-3、PD-1表达的相关性;采用Log-rank检验比较不同组别的生存期;采用Cox比例风险回归模型评估DFS和OS的独立预测因素;采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析;采用Graphpad Prism 7.0作图软件进行数据绘图。研究结果本研究共纳入178例肺癌患者。根据肿瘤出芽分级,将患者分为0级TB:59例,1级TB:47例,2级TB:72例。据统计分析,2级TB肺癌患者的5年总生存期（overall survival,OS）和 5 年无病生存期（disease-free survival,DFS）要低于 0 级和 1级的 TB 患者（5-year,58.9%vs.87.9%和 74.8%,p＜0.001）,其结果与 DFS 相似（5-year,51.5%vs.86.3%和65.1%,p＜0.001）。通过将高、低级别TB和N分期结合统计,我们发现 OS（5-year,42.6%,p=0.002）和 DFS（5-year,34.9%,p＜0.001）在高分级TB和N1N2的患者组中最差。此外,我们进一步发现TB与高TILs密度（p＜0.001）和PD-1阳性表达（p=0.038）呈现显著相关性。多变量分析显示,TB和免疫微环境标记物（如TILs和TIM-3）都对肺癌患者的OS和DFS产生独立影响。亚组分析显示,TB高级别TILs低密度或TIM-3高表达的患者组具有最低的OS（5-year,49.2%或44.7%,p＜0.001 或 p=0.001）和 DFS（5-year,37.5%或 34.7%,p=0.013 或 p＜0.001）,而TB低级别与TILs高密度或TIM-3低表达的患者组具有最佳的OS（5-year,87.9%或 85.8%,p＜0.001 或 p=0.001）和 DFS（5-year,83.9%或 79.5%,p=0.013 或 p＜0.001）。研究结论TB是肺癌患者NO和N1N2期的独立预后因素,其与肿瘤免疫微环境的状态息息相关。结合TB和TIM-3和/或CD8+TILs密度可进一步将患者分为不同的预后组。本研究表明了 TB与肺癌浸润边缘免疫微环境之间存在相互作用,为肺癌进展的机制提供了又一种可能。