【摘 要】
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目的:体内成骨过程主要由血肿机化期、骨痂形成期和骨痂改造塑形期组成,各时期的细胞群体、细胞因子等构成了不同的成骨微环境。骨膜作为种子细胞的来源和生长支架,其结构和功能对于骨愈合至关重要。本研究旨在构建一种简单易得的功能性仿生骨膜,实现对不同时期成骨微环境的响应和调控,最终达到加速骨修复的目的。方法:首先我们利用静电纺丝技术制备左旋聚乳酸（Poly-L-Lactic Acid,PLLA）纳米纤维支架
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目的:体内成骨过程主要由血肿机化期、骨痂形成期和骨痂改造塑形期组成,各时期的细胞群体、细胞因子等构成了不同的成骨微环境。骨膜作为种子细胞的来源和生长支架,其结构和功能对于骨愈合至关重要。本研究旨在构建一种简单易得的功能性仿生骨膜,实现对不同时期成骨微环境的响应和调控,最终达到加速骨修复的目的。方法:首先我们利用静电纺丝技术制备左旋聚乳酸（Poly-L-Lactic Acid,PLLA）纳米纤维支架膜,再通过聚多巴胺（Polydopamine,PDA）结合瘦素受体抗体（Leptin Receptor antibody,LepR-a）,并搭载含有骨形态发生蛋白 2（Bone Morphogenetic Protein 2,BMP2）的介孔二氧化锰（MnO2）纳米颗粒,制备功能性仿生骨膜PLLA-PDA-LepR-Mn02（BMP2）。然后我们对功能性仿生骨膜进行了表征,利用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,SEM）,X射线光电子能谱技术（X-ray Photoelectron Spectroscopy,XPS）和共聚焦荧光显微镜验证材料接枝效果;并检测了仿生骨膜的水接触角（Water Contact Angle,WCA）,应力应变曲线和药物释放曲线等理化特性;利用细胞骨架染色,细胞增殖实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）和细胞活死染色检验仿生骨膜的生物相容性。最后我们在体内外验证了仿生骨膜的成骨效果,通过细胞黏附、Transwell细胞迁移实验和Prx1-Cre/ERT2,-EGFP基因小鼠颅骨缺损模型中细胞募集实验,在体内外评价仿生骨膜的干细胞募集作用;再通过碱性磷酸酶（ALP）染色,茜素红（ARS）染色和RT-qPCR检测成骨相关基因Alkaline Phosphatase（Alp）、Collagen Type I（Col-1）、Osteocalcin（Ocn）、Osteopontin（Opn）、Runt Related Transcription Factor 2（Runx2）的表达情况,研究仿生骨膜的体外成骨性能;利用小鼠的颅骨缺损模型,通过Micro-CT、苏木素-伊红（H＆E）染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色,检测骨修复效果并探究仿生骨膜促进成骨的潜在机制。结果:我们制备的PLLA支架具有均匀的纤维结构,PDA修饰有利于促进MnO2均匀分散附着在PLLA支架表面;XPS显示PDA使PLLA支架出现了新的氮元素峰（N1s）,且添加MnO2的仿生骨膜也检测到了 MnO2特征峰,共聚焦荧光显微镜显示LepR-a可以均匀接枝在PLLA-PDA的表面;PLLA支架原本疏水,但是经PDA改性后,WCA由原先114.70±3.91°下降至0°;经应力应变检测,仿生骨膜较原PLLA电纺丝力学强度上无明显差异,但CCK-8检测表明材料接枝了 LepR-a和MnO2（BMP2）之后,更利于细胞的增殖,细胞的活死染色显示MnO2可以提高细胞在H2O2环境中的存活率。体外体内实验均显示,接枝了 LepR-a的材料都募集到了更多的骨骼干细胞（Skeletal Stem Cell,SSC）;体外的ALP染色和ARS染色都显示,在同一时期,PLLA-PDA-LepR-MnO2（BMP2）功能性仿生骨膜上细胞的碱性磷酸酶活性最高,钙盐沉积最明显;RT-qPCR 显示 PLLA-PDA-LepR-MnO2（BMP2）组 Alp、Col-1、Ocn、Opn、Runx2的基因表达显著高于其他组（p＜0.05）;动物实验和染色显示在4周内PLLA-PDA-LepR组与PLLA-PDA-LepR-MnO2（BMP2）组成骨效应显著高于其他组,而在8周时,PLLA-PDA-LepR-MnO2（BMP2）组成骨效应显著高于另外四组,差异具有统计学意义（p＜0.05）。此外,我们通过免疫荧光染色发现应用仿生骨膜可有效改善骨缺损区域的炎症环境改善,并促进成骨特异性毛细血管再生。结论:本研究根据骨愈合的生理需求,按照组织工程学思路,构建了一种成骨微环境响应性仿生骨膜。该仿生骨膜具有良好的生物相容性和理化特性。在体内应用中,该仿生骨膜可通过表面的LepR-a加速干细胞在骨缺损部位的原位募集;同时其负载的MnO2（BMP2）微球可响应骨缺损区域的炎症微环境,一方面通过MnO2调节炎性微环境,另一方面通过持续释放BMP2促进成骨,实现对骨缺损的序贯治疗。同时,该仿生骨膜可以促进H型血管生长,在骨缺损修复领域具有较好的应用潜力。
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