【摘 要】
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非编码小RNA（small non-coding RNA,sRNA）是一类新近发现的在很多细菌中大量存在的基因表达调控子。主要通过特异性的短序列与mRNA进行碱基配对或与蛋白质发生相互作用进而调控许多细菌生理过程,如营养物质代谢、铁离子内稳态、氧压力应答等。尽管sRNA在细菌生理调控过程有着非常重要的地位,但是目前尚且缺少有效的细菌体内鉴定sRNA调控靶标的方法。因此,本研究的目的是构建一个分枝杆
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非编码小RNA（small non-coding RNA,sRNA）是一类新近发现的在很多细菌中大量存在的基因表达调控子。主要通过特异性的短序列与mRNA进行碱基配对或与蛋白质发生相互作用进而调控许多细菌生理过程,如营养物质代谢、铁离子内稳态、氧压力应答等。尽管sRNA在细菌生理调控过程有着非常重要的地位,但是目前尚且缺少有效的细菌体内鉴定sRNA调控靶标的方法。因此,本研究的目的是构建一个分枝杆菌sRNA调控靶标双质粒筛选系统,以用于鉴定分枝杆菌中sRNA的调控靶标。具体过程及结果如下:1)以质粒pMycVec1和pMycVec2为基础,改造后获得了用于克隆sRNA的质粒pMycVec2-D及用于克隆靶标基因的pMycVec1-Lac Z和pMycVec1-GFP报告质粒。pMycVec2-D中的sRNA通过强启动子rrn Bp启动转录并添加一个有效转录终止子。pMycVec1-Lac Z及pMycVec1-GFP通过一个较弱的启动子启动靶标序列的转录,并分别利用报告基因lac Z或gfp来报告靶标序列的翻译水平。2)双质粒系统功能验证。将已证明有调控效果的sRNA/靶标基因对MicC/ompC和MicF/ompF克隆至改造的质粒中,通过β-半乳糖苷酶活性及荧光值报告sRNA的调控效果。结果发现MicC/ompC和MicF/ompF共表达菌株的报告基因的表达明显受到抑制,而MicC/ompF和MicF/ompC共表达菌株的报告基因的表达不受影响,表明构建的双质粒系统可以检测sRNA与其调控靶标的相互作用。3)筛选耻垢分枝杆菌sRNA SM74的调控靶标。首先是预测SM74可能的调控靶标,并通过测定SM74与预测的调控靶标共表达菌株的β-半乳糖苷酶活性鉴定SM74的潜在调控靶标。但实验结果显示没有筛选到SM74的调控靶标。总体来说,本研究构建了一个筛选鉴定细菌sRNA调控靶标的双质粒系统,并利用该系统进行分枝杆菌sRNA SM74调控靶标的筛选。分析表明该系统虽然目前不能确定能否进行大量的sRNA调控靶标的筛选,但是能够确定该系统可用于验证sRNA与靶标的相互作用。此外,我们希望通过进一步研究将该系统用于sRNA的靶标筛选,为研究sRNA在细菌基因表达调控过程中的作用机制奠定基础。
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