论文部分内容阅读
目的micC是一种编码小分子非编码RAN(small non-coding RNA, sRNA)的基因，存在于多种革兰阴性细菌基因组内。micC位于E.coli基因组ompN与ybdK基因之间，其中ompN与ybdK转录方向一致，而与micC转录方向相反。micC启动子位于ompN与micC基因间，长度为227个碱基对（base pair, bp）。该启动子是否具有双向转录活性还未知晓，micC的应激性表达仍有待进一步探索。本文对micC启动子的双向转录活性、micC应激性表达进行了研究。方法（1）本研究以大肠埃希菌DH5ɑ为实验菌株，用天根生物科技公司产的试剂盒提取其基因组，以其为模板，设计引物分别扩增micC基因227bp、485bp的5＇侧翼序列，并分别正向、反向连接到质粒pJRS462表达β-葡萄糖苷酸酶（beta-glucuronidase，gus）报告基因的上游构建报告载体，检测携带各报告载体菌株的GUS活性。（2）在实验（1）正反向启动子都有活性的情况下，利用Red重组系统将各启动子连同gus报告基因和卡那霉素抗性基因重组到DH5ɑ基因组上，对启动子特性进行验证。（3）检测各重组菌在各种应激条件下的GUS活性，如温度、酸碱度、渗透压、抗生素、氧化应激刺激等。结果（1）250bp和500bp的DNA片段正向、反向插入到质粒gus报告基因上游后，均检测出gus基因表达，实验组GUS活性是阴性对照组的两倍以上。（2）启动子连同gus基因和筛选标记成功重组到DH5ɑ基因组上；重组菌进入稳定生长期后GUS活性大幅度提高。（3）在不同应激环境下，各重组菌gus基因表达水平不尽相同：GUS活性随着温度升高而升高，随着温度的降低而降低；GUS活性随着渗透压的增高而降低；氧化应激条件下，正向启动子诱导的GUS活性表达升高，而反向启动子GUS活性无显著变化；在pH应激下，GUS活性无明显改变。结论1.介于micC与ompN基因间的DNA序列为一个双向启动子。2.同一长度的启动子其正、反向间的转录活性没有差异。3.细菌进入稳定期后micC启动子表达大幅度提高。4. micC启动子主要受温度和渗透压刺激的调节：在温度升高时，正反向启动子表达都增高，反之都降低；正反向启动子在高渗下表达都降低。5.氧化应激促进正向启动子表达，而对反向启动子表达没有影响。6. micC启动子对pH应激不敏感，细菌可能通过其它通路应对pH刺激。