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研究背景失眠(insomnia)是最常见的睡眠障碍(sleep disorders,SD),是多种躯体、精神和行为疾病所具有的常见临床表现,长期失眠会给人的正常生活和工作带来严重的不利影响,甚至会造成严重的意外事故。但其发生的确切机制目前仍不明了。觉醒与睡眠周期的调节主要与脑干的网状结构有关,其中有睡眠诱导功能的上行网状抑制系统(ascending reticular inhibitory system, ARIS)和上行网状激动系统(ascending reticular activating system, ARAS)的动态平衡决定着睡眠-觉醒周期的变化。γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid,GABA)是哺乳动物中枢神经系统中最主要的抑制性神经递质。GABA与GABAA受体的结合使氯离子(chloride ion,Cl-)通道开放的频率增加,大量Cl-流入细胞膜内,引起突触膜超极化,产生抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential, IPSP)而发挥神经抑制功能。GABA转运体(gama-aminobutyric acid transporter, GAT)是一种主要位于神经元及胶质膜上的糖蛋白,属于Na+/Cl-转运蛋白家族,其亚型有GAT-1、GAT-2、GAT-3、GAT-4/BGT1和TAUT。GAT在脑组织内分布广泛,能摄取突触间隙及细胞外液的GABA,终止GABA的抑制作用,与生理病理过程关系密切。GAT表达的异常会导致GABA能神经信号传递的变化,进而导致临床上多种神经系统疾病。在神经系统发育、癫痫、精神分裂等诸多生理病理条件下,广泛存在GAT的变化。提示GAT通过影响GABA能神经元,在神经兴奋／抑制的平衡中扮演着重要的角色,而失眠正是一种神经兴奋／抑制功能失衡导致的临床疾病。地西泮(安定)是治疗失眠的经典药物,属苯二氮卓受体激动剂,通过促进GABA与GABAA受体的结合而发挥神经抑制功能。在失眠及其治疗的过程中,GAT-1会发生怎样的同步变化,目前国内外尚未见相关报道。目的本研究拟采用腹腔注射对氯苯丙氨酸(ρ-chlorophenylalanine, PCPA)制作大鼠失眠模型,并同步设立生理盐水对照组和地西泮干预组,检测大鼠脑干组织中GAT-1mRNA和GAT-1蛋白的表达变化,初步探讨其与失眠的关系,以寻找临床治疗失眠的新靶点。方法1.动物分组及处理：采用清洁级健康成年雄性Sprague Dawley大鼠为实验对象,共36只,体重180～220g。随机分为模型组、对照组和干预组三组,每组12只动物。①模型组：每日上午8：30～9：00腹腔注射PCPA300mg/kg制作实验性失眠大鼠模型,连续2天。其中PCPA用略碱性生理盐水(pH：7～8)溶解,按1ml／100g配制成混悬液。第三天以蒸馏水按1ml／100g灌胃,连续5天；②对照组：每日上午8：30～9：00以生理盐水按1ml／100g进行腹腔注射,连续2天,第三天以蒸馏水按1ml／100g灌胃,连续5天；③干预组：同模型组腹腔注射PCPA建立失眠模型之后,第三天用地西泮水溶液灌胃,0.92mg/kg,每日上午8：30～9：00一次,连续5天。其中地西泮片用蒸馏水溶解,按1ml／100g配制成水溶液。2.实验动物行为学观察及体重测量：每天定时观察大鼠行为学表现,每3小时录制大鼠活动视频半小时,纵横双向比较大鼠行为学的改变。分别于入组时、第一次腹腔注射PCPA前、第一次灌胃前及处死大鼠取材前当天上午8：00～8：20测量所有大鼠体重并记录。3.将各组受试动物于开始灌胃治疗后第6天快速断头处死,取大鼠脑干组织,超低温保存。4. RT-PCR法和WB法检测大鼠脑干GAT-1的表达。结果1.大鼠行为学表现：对照组大鼠无明显变化。模型组和干预组大鼠于第一次腹腔注射PCPA混悬液28～30h后,出现昼伏夜出的节律消失等失眠表现,模型成功率94.4%。干预组大鼠地西泮灌胃后失眠症状较模型组均逐渐恢复。2.体重变化：入组时、第一次腹腔注射PCPA前三组大鼠体重相当；第一次灌胃前模型组和干预组体重相当,但较对照组均减轻(q=5.403,p<0.01；q=5.508,p<0.01)；处死大鼠取材前模型组与干预组较对照组均减轻(q=12.214,p<0.01；q=8.045,p<0.01),干预组较模型组增加(q=4.166,p<0.05)。3.与对照组相比,模型组和干预组GAT-1mRNA的表达均降低(q=26.522,p<0.01；q=44.468,p<0.01),干预组较模型组表达更低(q=17.924,p<0.01)。4.与对照组相比,模型组和干预组GAT-1蛋白的表达均降低(q=11.174,p<0.01；q=16.571,p<0.01),干预组较模型组表达更低(q=5.397,p<0.01)。结论1.脑干GAT-1表达下调可能与失眠后机体的保护性机制有关。2.地西泮下调GAT-1可能是其发挥催眠作用的机制之一。