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柚皮苷是一种二氢黄酮类化合物,是芸香科植物,如葡萄柚、蜜柚、酸橙等的主要苦味物质。柚类果实中的柚皮苷含量在100 ppm～370 ppm之间,使得在制成果汁时,让消费者难以接受,这严重影响了柚类果汁行业的发展。柚皮苷的苦味脱除的方法主要有:吸附脱苦法、化学脱苦法、β-环糊精包埋法、酶法等。其中,利用微生物产生的柚苷酶进行脱苦具有条件温和、无污染、无次级产物等优点,是最具前景、最理想的脱苦方法。目前市场上还缺乏可应用于工业化生产的商品酶,其主要原因是缺乏产柚苷酶的高产菌株。在前期研究中,本实验室以从蜜柚中提取的苦味物质为唯一碳源配制选择性培养基,分离获得了40株能利用柚皮苷的微生物。本研究从这些菌株中筛选产酶活力高、安全性高的菌株,研究其产酶性质,选育柚苷酶的高产菌株,为后续研究提供基础。对40株产柚苷酶的微生物进行筛选,柚苷酶活力相对较高的三菌株的编号分别为DB054、P-127和4-4-1,柚苷酶活力分别为108.6 U/mL,103.6 U/mL、114.3 U/mL。经初步鉴定,菌株DB054为曲霉属(Aspergillus Mich.ex Fr.),菌株P-127为常现青霉属(Penicillium Lk.ex Fr.),菌株4-4-1为镰孢霉属(Fusarium Lk.ex Fr.)。对黑曲霉DB054产柚苷酶特性研究,确定了菌株产生的柚苷酶为胞外、诱导酶;分析了菌株DB054在摇瓶及5 L发酵罐中的产柚苷酶规律。黑曲霉DB054存在分解代谢物阻遏,葡萄糖对柚苷酶的合成具有强烈的抑制作用;黑曲霉DB054的菌丝体形态对柚苷酶合成有重大影响,丝状菌体比球状菌体更适合发酵柚苷酶。通过改变摇床培养方式或培养基中添加乳化剂可以改变菌丝形态或细胞膜结构,提高细胞膜的通透性,促进在细胞内合成的柚苷酶分泌到胞外。对黑曲霉DB054进行人工诱变育种研究,以期筛选到产柚苷酶的高产菌株。用30μL/mL甲基磺酸乙酯对出芽8 h的黑曲霉DB054孢子诱变处理40 min,在培养基中添加5 mg/mL的二脱氧-D-葡萄糖淘汰低产菌株,用改良的Davis方法制备透明圈,根据透明圈的HC值初步筛选柚苷酶高产菌株。用透明圈法初筛出的菌株中,产量提高40%以上的突变菌株占11%;用摇瓶培养对初筛出的菌株进行两轮复筛柚苷酶高产突变株T-226,摇瓶培养柚苷酶活达373.4 U/mL,比出发菌株提高了22.7%。对该高产突变株进行5 L罐发酵实验,在发酵第84 h测得柚苷酶活为631.9 U/mL。用新建立的方法选育高产柚苷酶的高产菌株,不仅具有较高的筛选效率,还具有良好的准确性。