1992年，美国NIH批准了第一个神经分子外科临床方案，即运用逆转录病毒载体（Retrovirus，RV）介导单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／环丙氧苷（HSR-tk／GCV）系统治疗脑胶质瘤，在全球范围内引起了医学界人士对恶性肿瘤基因治疗的广泛关注。目前世界上共有232项基因治疗临床试验方案获准进行，其中105项是针对恶性肿瘤的基因治疗，14项是针对脑胶质瘤，但至今取得理想治疗效果的报道甚少。随着人脑胶质瘤基因治疗的基础及临床研究不断发展，越来越多的联合治疗方案的提出，将为人脑胶质瘤的治疗提供全新的模式。本研究旨在构建一种安全、无辅助病毒污染的、无病毒基因的新型rAAV病毒载体，验证其转染效率。在此基础上进一步验证该载体携带血管抑素基因和野生型p53基因在体内条件下联合治疗恶性胶质瘤的效果，探索一套安全、有效治疗胶质瘤的基因治疗方法。研究分三步进行：1．重组腺病毒相关病毒（reconstruct adenovirus-associated virus，rAAV）-阳离子脂质体（LyoVec）载体的构建及评价本研究构建了rAAV-GFP无病毒基因的且无辅助病毒污染的病毒载体、rAAV-GFP-LyoVec新型载体，体外实验测定此两种载体及LyoVec-GFP对定量C6细胞的转染率，筛选并确定高转染率载体，按产业化标准进一步完善其构建方式，为该载体携带血管抑素和野生型p53联合基因治疗C6胶质瘤做准备。2．裸鼠C6胶质瘤模型的建立及鉴定裸鼠肿瘤模型是人们研究人类肿瘤生物特性以及肿瘤治疗常用的实验模型，适用于异种动物组织的移植和人类肿瘤异种移植。这种模型可以保持原发肿瘤本身所具有的形态特征和遗传性。本实验为研究人脑胶质瘤的基因治疗效果建立了裸鼠C6胶质瘤的模型，体内、体外实验免疫组化检测GFAP蛋白的表达，鉴定其遗传性，研究其病理组织学特征。3．rAAV-LyoVec高转染率载体介导血管抑素及野生型p53联合基因治疗C6胶质瘤用rAAV-LyoVec载体介导血管抑素基因及野生型p53基因联合治疗C6胶质瘤。观察所构建的裸鼠C6胶质瘤模型中各组不同时间段肿瘤体积变化，免疫组织化学分析血管抑素基因、野生型p53基因及相关蛋白的表达，电镜观察C6细胞凋亡、病毒转染、组织坏死等情况，RT-PCR确认血管抑素基因在分子水平表达。从组织、细胞、蛋白及分子水平研究rAAV-LyoVec载体介导血管抑素及野生型p53联合治疗C6胶质瘤的效果。实验材料及方法1．rAAV-LyoVec载体的构建及评价1．1无病毒基因的病毒载体构建：通用型AAV载体pSNAV、含GFP基因表达盒的AAV载体质粒的构建采用文献方法进行，得到的重组质粒为pSNAV-GFP，转染的293细胞，将其进行G418抗性筛选，得细胞株命名为293-SG1。293-SG1在37℃5％CO₂培养箱培养72h后，搜集细胞，低速离心，去上清，将细胞团快速冻融3次，裂解液在55-60℃加热30min以灭活残存腺病毒，低速离心去除细胞碎片得rAAV-GFP粗提物，纯化后，按照氯仿处理-PEG／NaCI沉淀-氯仿抽提浓缩法进一步纯化，收集细胞及培养液，加入10％体积的氯仿，剧烈振摇，加入固体NaCI至终浓度为1mol／L，离心，收集上清，加入PEG8000至终浓度为10％，离心，弃上清，用PBS重悬沉淀，加入DNaseI至终浓度为1ug／ml，氯仿抽提，收集水相即为纯化的rAAV-GFP。1．2 rAAV-GFP-LyoVec新型载体的构建准备rAAV-GFP 80ul，加入RPMI 1640液320ul，LyoVec2ml，取TMAG：DLPC：DOPE摩尔比率是1：2：2（总量是1umol），溶解在0.5ml氯仿中，溶剂蒸发，脂膜浸湿在0.2ml含有1.5×10⁸rAAV-GFP粒子的PBS溶液中，用涡轮搅拌器混合搅拌2min，悬浮体积用PBS溶液调到0.5ml，未捕获rAAV-GFP的LyoVec载体通过浮选转移到Ficoll梯度上。此0.5ml溶液含有rAAV-GFP联接LyoVec，它包括1.5×10⁸rAAV-GFP粒子／umol脂质。脂质体的数量已控制在15nmol／ml脂质（1.5×10⁸粒子／ml），至此含1.5×10⁸rAAV-GFP-LyoVec粒子新型载体0.5ml构建完毕。放入37℃5％CO₂培养箱保存。1．3 rAAV-GFP，LyoVec-GFP，rAAV-GFP-LyoVec新型载体三组体外转染定量C6细胞，倒置荧光显微镜记数，转染率比较。体外转染用量：MOI（multiplicity of infection）为10⁵v．g／cell。即病毒基因组数（v．g）与转染细胞之比为10⁵。2．裸鼠C6胶质瘤模型的建立及鉴定2．1动物：6只15周雌性裸鼠，体重15—20g，购于中国医科大学动物部。2．2细胞培养：大鼠C6胶质瘤细胞培养在含10％血清的DMEM培养基（青霉素105u／L，链霉素100mg／L）中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养至对数生长期。2．3瘤细胞悬液接种法：取对数生长期细胞，经0.25％胰蛋白酶消化，离心弃上清，用无血清培养液DMEM离心洗涤2次，计数细胞数，调整细胞浓度，将细胞悬浮于PBS（0.01mol／L pH7.4）中，细胞浓度为5×10⁶／ml。抽取细胞悬液200ul（1×10⁶个），接种6只裸鼠的腋下。2．4肿瘤的观察和测量裸鼠接种完毕后，置恒温（25±2℃）、恒湿（45％～50％）、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便。三维卡规测量：V（cm³）=πD³／6（D为肿瘤最大及最短径的平均值），绘制裸鼠瘤体体积-时间曲线。2．5病理组织学检查处死裸鼠，观察移植瘤的形态。取肿瘤组织固定于10％福尔马林溶液中，石蜡包埋，组织切片，常规HE染色，组织病理检查。2．6免疫组化检测GFAP蛋白的表达取体外培养的C6胶质瘤细胞爬片以及裸鼠移植瘤组织，免疫组化（ABC法）检测GFAP蛋白的表达，阳性细胞呈现胞浆棕黄色着染，胞核苏木精复染。3．rAAV-LyoVec高转染率载体介导血管抑素及野生型p53联合基因治疗C6胶质瘤3．1取36只C6胶质瘤模型裸鼠，随机分为6组，每组各6只：1组PBS空白对照2组LyoVec对照3组rAAV-p53-LyoVec4组rAAV-angiastain-LyoVec5组rAAV-p53-LyoVec+rAAV-angiastain-LyoVec6组卡铂组（澳大立亚科鼎公司提供）C6细胞悬液接种法接种4d后，各组鼠均已成瘤，瘤体内注射治疗，1组各鼠分别加入PBS 50ul，2、3、4、5组按50ul／只（1.5×10⁸粒子／ml）注射各组基因，6组按0.3mg／20mg体重（10mg／ml）注射，每24h注射一次，分别在4d，12d，20d，28d，36d测量成瘤体积。三维卡规测量：V（cm³）=πD³／6，D为肿瘤最大及最短径的平均值。3．2免疫组织化学检测及HE染色：取各组C6移植瘤，常规脱水，透明，石蜡包埋封固，切片，免疫组化SABC法检测各组胶质瘤内p53，血管内皮生长因子（VEGF），CD34蛋白产物的表达。3．3 RT-PCR进一步测定angiastain各组C6转染细胞中分子水平表达引物由中科院上海生物工程公司合成：EcoRI引物1 5’AGGAATTCATGGTGTTGCAGAC-CCAGGTCT-TCATTTCTCTGTTGCTCTGGATC-TCTGGTGCCTACGGGGCTGAAAACAG-GAAGTCCTC 3’引物2 5’AAGTCGACTTATTGTTCCGTG-GATACTGG 3’提取4、5两组C6转染细胞胞浆中的RNA及poly（A）+RNA，然后进行cDNA合成，将cDNA直接用于PCR扩增，反应结束后，样品4℃保存。取5ul反应液置琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察结果。实验结果1．rAAV-LyoVec载体的构建及评价1．1成功构建rAAv-GFP LyoVec新型载体，1．2 rAAV-GFP，LyoVec-GFP，rAAv-GFP-LyoVec三组载体体外转染C6细胞，MOI（multiplicity of infection）为10⁵v．g／cell。即病毒基因组数（v．g）与转染细胞之比为10⁵。倒置荧光显微镜记数，转染率比较。rAAV-GFP-LyoVec组高于rAAV-GFP组和LyoVec-GFP组。2．裸鼠C6胶质瘤模型的建立及鉴定建立了裸鼠C6胶质瘤模型，裸鼠的腋下移植瘤生长潜伏期为4天，绘制裸鼠肿瘤体积-时间生长曲线。3．rAAV-LyoVec高转染率载体介导血管抑素及野生型p53联合基因治疗C6胶质瘤3．1建立了肿瘤体积-时间生长曲线。3．2免疫组织化学检测及HE染色显示，各组细胞p53、VEGF及CD34蛋白均有不同程度的表达。3．3在4、5组经RT-PCR获得一个基因片断，电泳证实为angiastain基因片断，其它组未见。结论1．新构建rAAV-LyoVec载体基因的转染效率远远高于rAAV或LyoVec独立转染。2．裸鼠C6胶质瘤模型作为肿瘤基因治疗最重要的动物模型，可以保持原发肿瘤本身所具有的形态特征及遗传性。3．rAAV-LyoVec高转染率载体介导血管抑素及野生型p53基因联合治疗C6胶质瘤，对比血管抑素及野生型p53单基因治疗效果显著，证明了联合基因治疗是治疗脑胶质瘤的有效方法。