【摘 要】
：
本研究以课题组前期从英红九号中克隆到的yhNMT1基因及其对应筛选到的4个候选转录因子基因yhTF1～yhTF4为材料,利用酵母杂交分析技术结合烟草转基因研究候选转录因子对yhNMT1基因的调控激活活性,通过EMSA技术验证转录因子与yhNMT1基因启动子yhPNMT1的体外结合特性。另外,通过重组DNA技术,分别构建了 4个候选转录因子的RNA干涉转基因载体、CRISPR/Cas9基因打靶载体和
【基金项目】
：
国家自然科学基金项目（项目编号31770727）； 广州市科技计划项目（项目编号201607010139）； 现代农业产业技术体系（茶叶CARS-19）；
论文部分内容阅读
本研究以课题组前期从英红九号中克隆到的yhNMT1基因及其对应筛选到的4个候选转录因子基因yhTF1～yhTF4为材料,利用酵母杂交分析技术结合烟草转基因研究候选转录因子对yhNMT1基因的调控激活活性,通过EMSA技术验证转录因子与yhNMT1基因启动子yhPNMT1的体外结合特性。另外,通过重组DNA技术,分别构建了 4个候选转录因子的RNA干涉转基因载体、CRISPR/Cas9基因打靶载体和基因超表达转化载体,利用农杆菌介导的转基因技术对茶叶愈伤组织分别进行遗传转化,对得到的各抗性愈伤组织经转基因真实性鉴定后,比较分析转基因前后愈伤组织中合成酶基因、转录因子基因的表达变化,并测定比较对应材料中的咖啡碱含量,探讨转录因子对茶树咖啡碱合成的调控作用,获得的研究结果主要如下:（1）yhTF1～yhTF4基因转录活性分析yhTF1～yhTF4在酵母细胞中的转录活性分析:将yhTF1～yhTF4的cDNA编码序列分别与pGBKT7载体的BD结构域融合,然后将重组载体转入酵母AH109中并进行测定。结果表明除yhTF2外,yhTF1、yhTF3、yhTF4在酵母细胞中均具有转录激活活性。为进一步确定具转录激活活性基因的转录激活区域,根据保守域位置将yhTF1、yhTF3、yhTF4分成两段分别构建进重组表达载体并测定,结果表明yhTF1的转录激活域位于C端,yhTF3和yhTF4的转录激活域位于N端。yhTF1～yhTF4在烟草中的转录活性分析:通过重组技术将yhPNMT1启动子替换pCAMBIA1301载体中的35S构建获得yhPNMT1-GUS报告载体,yhTF1～yhTF4基因序列分别和pRI101 AN连接构建过表达效应载体,将报告载体分别和4个基因的效应载体进行组合转入烟草叶片中。结果显示yhPNMT1-GUS报告载体和pRI-TF1、pRI-TF3、pRI-TF4效应载体分别组合共转,与单转yhPNMT1-GUS的烟草叶片相比,GUS染色程度加深,GUS酶活值提高,说明yhTF1、yhTF3、yhTF4基因能够激活yhPMMT1,促进yhNMT1基因的表达;yhPNMT1-GUS和pRI-TF2共转与单转yhPNMT1-GUS载体的烟草叶片相比,GUS染色程度和GUS酶活力没有差异,说明yhTF2基因对yhPNMT1没有促进表达作用。（2）yhTF1～yhTF4原核表达分析将yhTF1～yhTF4的cDNA编码序列分别插入蛋白表达载体pET32a中,转入蛋白表达菌BL21进行诱导表达。其中pET32a-yhTF1和pET32a-yhTF4诱导出分子量分别为59 kD和42 kD左右的可溶蛋白;pET32a-yhTF2诱导出蛋白但不溶于水,蛋白分子量约为69 kD;pET32a-yhTF3未诱导出蛋白。（3）EMSA实验分析yhTF1、yhTF4蛋白与yhPNMT1序列的体外结合将yhPNMT1分为yhPNMT1-N（363 bp）、yhPNMT1-C（399 bp）两段进行生物素标记作为探针,将表达纯化的yhTF1、yhTF4蛋白分别和两段启动子探针进行EMSA结合反应,发现TF1和TF4蛋白均能体外结合yhPNMT1的N端和C端序列,说明yhPNMT1序列上存在多个与TF1和TF4蛋白结合的位点。（4）过表达yhTF1～yhTF4的转基因功能分析将yhTF1～yhTF4基因分别和pCAMBIA1301-35SN过表达载体连接,获得4个基因的过表达重组载体,转化农杆菌EHA105后侵染英红九号愈伤组织,结果获得过表达yhTF3的转基因愈伤组织pTF3-1,qPCR检测发现与对照相比,pTF3-1的yhNMT1基因和yhTF3基因表达量均显著上调,HPLC检测发现转基因愈伤组织pTF3-1的咖啡碱含量显著升高。（5）CRISPR/Cas9基因敲除和RNA干涉yhTF1～yhTF4的转基因功能分析对4个转录因子基因各设计2个特异靶点,通过sgRNA表达盒插入CRISPR/Cas9植物双元表达载体中并经农杆菌介导转化至茶叶愈伤组织,结果敲除yhTF2基因的愈伤组织获得1个转基因愈伤组织CTF2-1,测序发现yhTF2基因序列在靶点位置出现碱基缺失和替换,CTF2-1的yhNMT1和yhTF2基因相对表达量均显著低于对照,对愈伤组织的咖啡碱含量进行高效液相检测,发现CTF2-1的咖啡碱含量相较正常愈伤组织显著下降。分别构建yhTF1～yhTF4的植物RNA干涉载体,农杆菌介导转化至茶叶愈伤组织。得到2个RNA干涉yhTF2转基因愈伤组织系RTF2-1和RTF2-2,qPCR检测基因相对表达量发现yhNMT1和yhTF2基因表达量均低于正常愈伤组织,咖啡碱含量也显著降低。
其他文献
CpG寡脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides,CpG-ODN）是一种含有胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的低聚脱氧核苷酸链,含有一个或多个非甲基化CpG基序（CpG motifs）。在细菌中普遍存在,具有免疫刺激活性,因此也称为免疫刺激序列（Immunostimulatory sequences,ISS）。CpG-ODN在固有免疫和适应性免疫应答中都发挥重要作用。可以激活TLR9产
丁酸梭菌是在畜禽肠道发挥肠道健康保护作用的益生菌,能作为饲料添加剂在畜牧养殖业中被广泛使用。猪源表皮生长因子（Porcine epidermal growth factor,pEGF）在猪胃肠道发挥修复损伤结肠黏膜屏障,促进胃肠道细胞增殖分化、抑制病原菌在胃肠道定植等作用的成果相继被发表。丁酸梭菌的全基因组信息已被揭示,可通利用丁酸梭菌的分泌蛋白信号肽的基因结构与功能,用丁酸梭菌同源信号肽分泌使丁
当今世界,以石油为主的化石燃料构建的能源框架所带来的环境问题困扰着全人类。由人类活动所产生的过量CO2造成了全球规模的温室效应。随着气候问题的凸显,开发更为有效的方法降低大气中的CO2含量变得尤为重要。其中,利用清洁的太阳能通过光催化的方式将CO2转化为具有使用价值的产品成为最受欢迎的方案之一。而光催化的核心则是制备高效的光催化剂。TiO2作为最常见的光催化剂,虽然具备众多优点,但同时也因光响应范
开发环境友好和精少量农药喷雾设备是我国现代农业植保领域的迫切需要。研究和开发高效的风送式喷雾机具有良好的应用前景。本文以喷雾液体的粘度为切入点,基于粘性液体射流雾化理论,应用计算流体力学和田间试验相结合的方法,研究喷雾液粘度对远射程风送式喷雾机雾滴参数（雾滴粒径,速度以及密度）的影响,初步探索了风场中雾滴集群的分布规律。主要研究内容及结论如下:（1）根据远射程风送式喷雾机的实际喷幅范围、喷筒结构以
车辆自动紧急制动系统（以下简称AEB）能够显著地提高车辆在行驶过程中的安全性。2014年,欧洲新车评估计划（Euro-NCAP）将AEB系统城市和城市间系统纳入其安全评级当中。2018年,中国新车评估计划（China-NCAP）的测试项目中正式加入车辆AEB测试。因此,针对自动紧急制动系统相关技术和控制策略的研究有着重要的现实意义。其中,控制策略的制定影响整个AEB系统的可靠性及精准性,与用户使用
我国养殖虾产量大,大部分用来加工虾仁,在此过程中会产生大量虾头、虾壳等副产物。这些虾头、虾壳占整虾质量的30%～40%,它们富含蛋白质、虾青素、脂肪酸等营养成分,可以作为海鲜调味基料的原料。本论文分别借鉴大豆酱油高盐稀醪发酵工艺和鱼露制作工艺以虾头、虾壳为原料制备调味基料,比较不同工艺的制作效果和制品风味。主要研究结果如下:（1）通过单因素实验和正交实验对制曲工艺参数进行优化,得到最佳的制曲工艺为
泰乐菌素（Tylosin,TYL）是一种由弗氏链霉菌（Streptomyces fradiae）产生的大环内酯类抗生素。TYL含有泰乐菌素A、B、C和D四种成分的混合物,其中泰乐菌素A占80%-90%。这四种成分均有不同的程度的抗菌活性,其中以泰乐菌素A的抗菌活性最高。恩诺沙星（Enrofloxacin,EF）是一种两性离子的分子,其p Ka1=5.88-6.06,p Ka2=7.70-7.74。
乙烯被称为植物催熟激素,采后果蔬因呼吸作用产生乙烯,当环境中乙烯浓度过高时,会加速果蔬的成熟与衰老,导致果蔬腐烂变质,造成损失和浪费。因此,减少或去除果蔬贮运过程中的乙烯对果蔬的贮藏与保鲜具有重要意义。半导体光催化技术因具有良好的氧化能力用于矿化环境中的有机污染已倍受关注,也为果蔬贮藏环境中乙烯的去除提供了新途径。光催化剂是光催化技术的核心,但目前已知的光催化剂大多存在光谱响应范围窄、量子效率低的
重金属污染土壤的高效修复和安全利用是我国目前亟需解决的重大农业、生态和环境问题,而植物修复技术因对环境友好而成为目前的研究热点。本研究以大生物量植物皇竹草与Cd超富集植物东南景天作为修复植物,主要探讨了聚天冬氨酸（PASA）和FM-1型肠杆菌在植物修复Cd污染土壤过程中的生态效应。主要研究结论如下:PASA、柠檬酸与低浓度的EDTA可显著降低土壤p H,提高土壤中Cd的有效态含量,而草酸、苹果酸、
本文旨在分析乳酸菌发酵虾壳制备甲壳素的工艺过程,对虾壳水解及发酵过程进行物料衡算,弄清了上述工艺过程中虾壳中的甲壳素、可溶性灰分、不溶性灰分、蛋白质、脂肪以及添加的葡萄糖等成分的转移规律;通过模拟体系研究体系了pH值、滴定酸度、乳酸钙浓度等因素对脱除虾壳中蛋白质和灰分的影响;研究了增强乳酸菌耐酸能力的因素,以及乳酸菌在发酵过程中生理状态的变化。在上述研究基础上,本论文提出以上一批发酵液预浸泡下一批