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背景多发性硬化（multiple sclerosis,MS）是一种常见的中枢神经系统（central nervous system,CNS）自身免疫性疾病,主要病理特征包括炎性细胞浸润、髓鞘结构破坏、轴索损伤和胶质细胞增生。MS患者临床表现包括神经功能减退、肢体肌无力、行动不便,认知和精神障碍等。认知障碍是MS患者常见临床症状之一,其发生率高达43%-70%。MS认知障碍随着病程的进展逐渐加重,严重影响患者的生活质量。但是到目前为止,MS认知障碍发病机制尚不明确,并且国内外MS相关研究大多集中于运动功能障碍及脊髓损伤,对于认知障碍和脑部病变的报道较少。因此探究MS认知障碍发生机制并寻找有效治疗手段及药物成为临床上亟待解决的问题。NLRP3炎性小体在MS发病过程中起到重要作用。抑制NLRP3炎性小体可以改善MS动物模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠的发病及运动障碍,但是NLRP3炎性小体是否直接参与MS认知障碍的发生尚不清楚。有研究证实,在EAE小鼠发病过程中,海马区小胶质细胞持续性激活并参与了海马神经元的损伤,且在中枢神经系统中,NLRP3炎性小体活化主要发生于小胶质细胞中,这提示NLRP3炎性小体可能在EAE小鼠认知障碍中发挥重要作用。此外,在具有典型认知障碍的阿尔茨海默病（Alzheimer disease’s,AD）模型中,NLRP3炎性小体同样参与了小胶质细胞激活和认知障碍的发生,敲除或抑制NLRP3都能够明显缓解AD模型小鼠的学习和记忆障碍,减少海马神经元损伤。上述研究说明,NLRP3炎性小体在MS和认知障碍中都扮演着重要角色,可能是两者间的桥梁。在神经系统疾病中,激活的小胶质细胞会引起星形胶质细胞增生,形成反应性星形胶质细胞。反应性星形胶质细胞可以分为神经损伤A1型和神经保护A2型两类。A1型反应性星形胶质细胞主要通过释放补体C3诱导神经元或少突胶质细胞凋亡;A2型反应性星形胶质细胞可以分泌神经营养因子,具有神经保护作用。研究证实,MS患者脑部病灶区域的星形胶质细胞表现为A1型激活,但是其在发病过程中的作用尚不清楚。本课题中,我们使用小分子抑制剂MCC950特异性抑制NLRP3炎性小体活化,探究了NLRP3炎性小体在EAE小鼠认知障碍的发生和星形胶质细胞表型调控中的作用。目的本课题拟探究NLRP3炎性小体参与星形胶质细胞的表型调控及在EAE小鼠认知障碍发生中的作用。不仅有助于阐明MS认知障碍的发病机制,而且能为其治疗提供新思路,新策略。方法（1）选取SPF级C57BL/6小鼠,随机分为对照组、EAE组和MCC950治疗组。将1 mg/m L MOG35-55和2 mg/m L弗氏完全佐剂等体积充分混匀,制成油包水乳剂,取200μL乳剂小鼠皮下4点注射进行免疫,同时腹腔注射200 ng百日咳毒素,48小时后再次注射200 ng百日咳毒素,构建EAE小鼠模型。其中MCC950治疗组在免疫第0天开始腹腔注射10 mg/kg的NLRP3特异性抑制剂MCC950,对照组和EAE组给予等量生理盐水。每日对三组小鼠进行观察,并记录临床评分和死亡率。当发病达到高峰期时,收集三组小鼠的脊髓和脑组织。通过H＆E染色和CD45免疫组化检测三组小鼠脊髓白质区炎性浸润。通过LFB染色、MBP免疫组化和电镜检测三组小鼠脊髓白质区脱髓鞘病变。通过Iba1（小胶质细胞标记物）免疫组化、ASC免疫荧光,CD68和NLRP3炎性小体相关蛋白（IL-1β,IL-18,Cleaved caspase-1 p10,NLRP3和ASC）的免疫印迹检测三组小鼠海马区小胶质细胞激活和NLRP3炎性小体活化。（2）EAE小鼠到达发病高峰期后,病情开始缓解,表现为运动功能恢复。持续对三组小鼠进行观察并记录临床评分,直至EAE小鼠表现为无明显运动功能障碍（发病后期）。使用Morris水迷宫实验和条件恐惧实验检测发病后期三组小鼠的认知功能。认知相关行为学实验结束后,收集三组小鼠脊髓样本,通过电镜检测三组小鼠髓鞘结构的完整性;收集三组小鼠的脑组织样本,通过H＆E染色,尼氏染色,高尔基染色和MAP2免疫组化检测三组小鼠脑部神经元病变,通过突触相关蛋白（SynapsinⅠ和PSD95）的免疫组化及免疫印迹检测三组小鼠脑部突触损伤。（3）选用发病后期三组小鼠的脑组织样本,通过A1型星形胶质细胞标记物C3d与星形胶质细胞标记物GFAP的免疫荧光双标和免疫印迹检测三组小鼠海马区星形胶质细胞表型变化。通过免疫印迹检测A2型星形胶质细胞标记物S100A10,研究给予MCC950能否促进星形胶质细胞由A1型向A2型转化。选用三组小鼠黑质致密区的切片,通过H＆E染色,尼氏染色,Tyrosine hydroxylase和Prokineticin-2免疫组化检测EAE小鼠是否存在多巴胺能神经元损伤,给予MCC950能否改善多巴胺能神经元损伤,和MCC950能否促进A2型星形胶质细胞的诱导因子Prokineticin-2表达增加。通过免疫荧光双标C3d和MAP2（成熟神经元标记物）或突触相关蛋白（SynapsinⅠ和PSD95）,检测C3d在EAE小鼠海马神经元和突触中的聚集情况。（4）NLRP3炎性小体活化会促进IL-1β和IL-18的成熟,因此我们培养小鼠原代星形胶质细胞,分别给予PBS,重组小鼠IL-1β和重组小鼠IL-18,孵育24小时,收集星形胶质细胞裂解液和培养上清（条件培养基,ACM）。使用RT-q PCR检测A1型星形胶质细胞相关标记物（H2-T23,Fkbp5,ligp1）和A2型星形胶质细胞相关标记物（Emp1,Cd109,S100A10）的转录水平变化。通过免疫印迹检测星形胶质细胞中C3d、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白水平变化,并且通过免疫荧光检测星形胶质细胞中NF-κB p65的核转位情况。（5）培养小鼠原代海马神经元,分为对照组,处理组和C3受体抑制剂处理组。对照组（Ctrl ACM）:去除海马神经元培养基,更换为PBS处理后的星形胶质细胞条件培养基;处理组（IL-18 induced ACM）:去除海马神经元培养基,更换为IL-18处理后的星形胶质细胞条件培养基;C3受体抑制剂处理组（IL-18induced ACM+SB）:预先加入10μM的C3受体抑制剂（SB290157）,60分钟后更换成IL-18处理后的星形胶质细胞条件培养基（含10μM SB290157）,孵育海马神经元3-5天。通过免疫荧光染色和免疫印迹检测三组海马神经元突触相关蛋白（SynapsinⅠ和PSD95）的密度和表达水平变化。通过免疫印迹检测三组海马神经元的Cleaved-caspase-3的表达水平变化。通过电生理技术记录三组海马神经元诱发动作电位（evoked AP）和自发性突触膜后电流（s EPSC）,检测海马神经元的兴奋性变化。结果（1）抑制NLRP3炎性小体可以减轻EAE小鼠发病高峰期临床评分和脊髓病理学改变。通过临床评分观察到EAE组小鼠在免疫后19天达到发病高峰期,表现为运动功能障碍,使用MCC950能够显著降低EAE小鼠发病高峰期的临床评分和死亡率。通过H＆E染色,LFB染色,CD45免疫组化,MBP免疫组化及电镜,观察到EAE小鼠脊髓白质区域出现明显炎性细胞浸润和脱髓鞘,而MCC950够显著降低EAE小鼠发病高峰期脊髓炎性浸润和脱髓鞘发生。免疫后40天,EAE小鼠到达发病后期,表现为运动功能恢复,临床评分和髓鞘厚度与MCC950治疗组无明显差异。（2）EAE小鼠海马区存在小胶质细胞激活和NLRP3炎性小体活化。通过Iba1免疫组化,观察到EAE组小鼠海马区小胶质细胞异常激活,而给予MCC950够显著降低小胶质细胞激活。通过Iba1和ASC免疫荧光双标,发现EAE组小鼠中ASC斑点主要聚集于Iba1阳性细胞中,且ASC+/Iba1+细胞的百分比明显高于对照组,而给予MCC950可以明显降低ASC+/Iba1+细胞的百分比。通过免疫印迹检测小胶质细胞激活标记物CD68和NLRP3炎性小体各个组装蛋白,观察到EAE组小鼠海马中CD68,pro IL-1β,IL-18,ASC和Cleaved-caspase-1 p10的表达水平均显著升高,而给予MCC950够显著降低相关蛋白的表达。（3）抑制NLRP3炎性小体可以改善EAE小鼠发病后期认知功能障碍和脑部神经元病变。通过Morris水迷宫实验和条件恐惧实验,观察到EAE小鼠发病后期存在明显学习和记忆障碍,而给予MCC950可以显著改善EAE小鼠的认知障碍。通过H＆E染色,尼氏染色,高尔基染色和Sholl同心圆分析,观察到EAE小鼠发病后期脑部神经元存在明显结构性病变,通过MAP2和突触相关蛋白（SynapsinⅠ和PSD95）的免疫组化,以及突触相关蛋白的免疫印迹,观察到EAE小鼠发病后期脑部存在明显神经元丢失和突触损伤,而给予MCC950可以改善EAE小鼠脑部神经元病变。（4）抑制NLRP3炎性可以促进EAE小鼠海马区星形胶质细胞由神经损伤A1型向神经保护A2型转化。通过免疫荧光双标GFAP（星形胶质细胞标记物）和C3d（A1型反应性星形胶质细胞标记物）,观察到EAE组小鼠海马DG区中GFAP和C3d具有明显共定位,且共定位百分明显高于对照组,而给予MCC950可以降低GFAP与C3d的共定位百分比。通过GFAP,C3d和S100A10免疫印迹,观察到EAE组小鼠海马中GFAP和C3d表达水平明显升高,S100A10表达降低,而给予MCC950可以降低C3d的表达,提高S100A10的表达。通过H＆E染色,尼氏染色,Tyrosine hydroxylase和Prokineticin-2免疫组化,观察到EAE小鼠黑质区多巴胺能神经元损伤,Prokineticin-2表达降低,而给予MCC950可以缓解EAE小鼠的多巴胺能神经元损伤,提高Prokineticin-2表达。（5）NLRP3炎性小体下游IL-18促进星形胶质细胞A1型转化。通过RT-q PCR检测A1型星形胶质细胞相关标记物（H2-T23,Fkbp5,ligp1）和A2型星形胶质细胞相关标记物（Emp1,Cd109,S100A10）的转录水平变化,观察到外源给予IL-18能够促进A1型星形胶质细胞相关标记物转录水平升高,A2型标记物转录水平降低。通过C3d,NF-κB p65,p-NF-κB p65免疫印迹及免疫荧光,观察到外源给予IL-18可以促进星形胶质细胞中C3d和p-NF-κB p65的表达增加,并且促进NF-κB p65入核。（6）IL-18诱导A1型星形胶质细胞释放C3,损伤海马神经元。通过MAP2和突触相关蛋白（SynapsinⅠ和PSD95）免疫荧光,Caspase 3免疫印迹,观察到加入IL-18处理后的星形胶质细胞条件培养基可以显著降低突触相关蛋白的密度和表达,且Cleaved caspase 3表达水平增加,说明IL-18处理的星形胶质细胞可以诱导海马神经元凋亡,而给于C3受体抑制剂SB290157可以明显改善突触丢失,降低神经元凋亡。通过电生理实验,观察到加入IL-18处理后的星形胶质细胞条件培养基可以显著降低诱发动作电位的数目,以及自发兴奋性突触后电流的振幅和频率,而给于SB290157可以明显提高海马神经元的兴奋性。结论（1）抑制NLRP3炎性小体可以改善EAE小鼠发病高峰期临床评分、炎性细胞浸润和脱髓鞘的发生。（2）EAE小鼠海马区存在小胶质细胞激活和NLRP3炎性小体活化。（3）NLRP3炎性小体参与EAE小鼠发病后期认知障碍发生和海马神经元损伤。（4）抑制NLRP3炎性小体促进EAE小鼠海马区星形胶质细胞由神经损伤A1型向神经保护A2型转化。（5）NLRP3炎性小体下游IL-18通过激活NF-κB通路诱导星形胶质细胞的A1型转化并释放补体C3,导致海马神经元损伤。