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水分胁迫是严重影响作物生产的环境胁迫之一。根据水分供应情况,稻类作物经过长期的人工选择和自然选择分化为水稻和旱稻,水稻是天然“敏旱类型”,旱稻则是“抗旱类型”,为了初步阐明水、早稻水分胁迫分子反应机制的差别,并据此发掘抗旱候选相关基因,我们进行了以下研究。
首先,为了获得早稻IRAT109的水分胁迫诱导表达基因,通过抑制性差减杂交(SSH)的方法,以15%PEG(6000)处理的早稻IRAT109幼苗为tester,未处理的对照材料为driver,构建了含有2112个克隆的差减cDNA文库。
为了分析水稻和早稻的水分胁迫分子应答机制的差异,将文库中所有克隆扩增、纯化后制作cDNA miroarray,每个克隆重复3次。以15%PEG(6000)处理的两个水稻品种(越富、日本晴)和两个旱稻品种(IRAT109、毫格劳)的根和叶片的RNA为检测样品与cDNA芯片杂交。结果显示芯片上绝大部分基因在水稻和早稻中的表达没有显著差别,通过T检验(p=0.05)鉴定了水、早稻差异表达EST 152个,其中早稻表达量大于水稻的EST 68个(叶片42个,根32个,6个重叠),水稻表达量大于早稻的EST 84个(叶片67个,根24个,7个重叠)。
对所有水、早稻差异表达EST进行测序,BLAST分析表明,大部分在旱稻中高表达的基因代表了与胁迫应答相关的转录因子(NAC蛋白、乙烯响应元件结合蛋白、包含AP2结构域蛋白)、以及与抵御活性氧伤害和维持细胞膨压有关的基因。而在水稻中高表达的基因则大多与抗旱无关甚至与胁迫造成的伤害反应有关,如与降解细胞组分有关的多聚半乳糖醛酸酶和α-半乳糖苷酶等。
通过芯片筛选发现一个在根和叶中都表现为旱稻表达量显著高于水稻的EST,经BLAST分析推测其代表的基因编码myo-肌醇加氧酶,为了进一步研究它的功能,我们克隆了该基因的全长cDNA。此外,我们还克隆了一个编码产物未知的旱稻高表达基因,这两个基因分别命名为OsMIOX和OsUNK1,并对这两个基因构建了植物超表达载体,为功能研究奠定基础。