论文部分内容阅读
纤维质是地球上存量最多的可再生生物资源。植物每年通过光合作用能产生的纤维素类物质高达1550亿t,其中纤维素、半纤维素的总量为850亿t。利用技术手段,将纤维素转化为容易被利用的单糖或多糖,对能源的获得具有重要意义。嗜热菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725能够利用多种纤维质材料为碳源,合成自身生命物质。该嗜热菌的基因组获得解析,其代谢途径相对比较清晰,为发现和利用该嗜热菌的代谢途径奠定了基础。通过生物信息学分析,我们发现该菌基因组中包含了一个糖原合成途径,在此基础上有可能构建一个新的以纤维素为原料合成糖原的人工途径。为此,本论文开展了相关研究。本论文首先运用生物信息学等手段,分析了该糖原合成途径中糖基转移酶、糖原合酶的蛋白质序列,此外,分析了纤维二糖磷酸化酶的蛋白序列,预测了各蛋白的功能。在此基础上,模建了各蛋白的结构模型,找到了相关的关键氨基酸位点和活性中心。以该菌株的基因组为模板,采用PCR的方法,获得糖原合酶(Athe-0555),糖基转移酶(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶)(Athe-0556,Athe-0557)和纤维二糖磷酸化酶(Athe-xl)的基因序列。分别将上述基因连接到不同表达载体中,转入E. Coli. Xl扩增,将表达载体转入不同宿主中进行表达,结果表明:Athe-0555在E. Coli. Rosetta中为可溶性表达,Athe-0556、Athe-0557和Athe-xl在E. Coli. BL21中为可溶性表达。SDS-PAGE蛋白凝胶电泳鉴定表明目的条带与理论分子量相近。对上述重组蛋白进行了镍柱亲和纯化,获得了电泳纯的的Athe-0557,Athe-xl两种重组蛋白,而重组蛋白Athe-0555和Ate-0556不能保留在镍柱上。后续的研究正在开展当中。通过本论文的研究,我们对体外合成淀粉所需要的几种酶进行了初步的研究。通过生物信息学技术模建了酶的结构模型,运用分子生物学手段获得了酶的基因,构建了相应的基因工程菌,进行了初步的诱导表达,获得了两个重组酶的纯蛋白。上述研究工作为开展相关研究奠定了基础。