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天然免疫系统是机体抵御病原微生物体入侵的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体（pattern recognition receptors,PPRs）对病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）或危险相关分子模式（danger associated molecular pattern,DAMPs）的识别,以激活下游信号通路,发挥抵御病原体入侵的功效。在抗病毒天然免疫反应中c GAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase,c GAS）（stimulator of interferon genes,STING）信号通路发挥关键作用。胞质DNA感受器环状鸟苷酸-腺苷酸合酶c GAS可识别病原体DNA、机体异常DNA或环状二核苷酸（cyclic dinucleotides,CDNs）[1],进而催化GMP（guanine monophosphate）、AMP（adenosine monophosphate）形成磷酸二酯键从而产生c GAMP（cyclic GMP-AMP）[2,3]。c GAMP可作为第二信使与干扰素基因刺激蛋白STING结合,促进其发生二聚化并激活下游TANK结合激酶（TANK binding kinase 1,TBK1）及Ik B激酶（I-kappa B kinase,IKK）,二者可分别激活转录因子IRF3（interferon regulatory factor 3）和NF-κB（nuclear factor kappa B）以诱导干扰素（interferon,IFN）及炎性因子的产生。STING分子作为调控IRF3及NF-κB信号通路的关键接头分子,其正确表达对机体能否产生有效的天然免疫应答至关重要,因此STING蛋白的功能调控受到广泛关注,目前研究多集中于翻译后修饰。蛋白质翻译后修饰（post-translationalmodifications,PTM）是指在蛋白质合成过程中及合成后发生的共价或酶促修饰。迄今为止已发现200多种翻译后修饰类型,其中泛素化修饰是除糖基化和磷酸化外最常见的修饰类型。泛素蛋白通过一个复杂的酶反应链催化共价结合到靶蛋白上行使功能,该反应链包括:E1泛素激活酶（ubiquitin-activating enzyme）、E2泛素偶联酶（ubiquitin-conjugating enzyme）和E3泛素连接酶（ubiquitin-ligating enzyme）。除此之外,机体还存在一系列类泛素蛋白（Ub-likeproteins,UBLs）,其三级结构与泛素蛋白相似,并且通过类似的酶反应链与靶蛋白结合以行使其生物学功能。UFM1（ubiquitin foldmodifier1）是新发现的UBLs之一,它可以介导Ufmylation类泛素化修饰。其特异性酶反应链包括E1激活酶UBA5（ubiquitin-like modifier activating enzyme5）、E2偶联酶UFC1（UFM1-conjugating enzyme1）、E3连接酶UFL1（UFM1-specific ligase1）以及去泛素化酶UFSPs（UFM1-specific proteases）。本课题前期预实验结果表明,病毒刺激后的原代巨噬细胞中E3连接酶UFL1的m RNA及蛋白表达明显降低,由此我们推测UFL1及Ufmylation修饰可能参与调控抗病毒天然免疫并展开研究。通过RNA干扰技术敲低原代巨噬细胞中UFL1的表达,并使用DNA病毒HSV（herpes simplex virus）、RNA病毒VSV（vesicular stomatitis virus）及外源核酸模拟物刺激,发现敲低UFL1导致干扰素β（interferon-β,IFN-β）和白介素6（interleukin-6,IL-6）的表达明显降低。但UFL1表达降低仅能促进HSV病毒复制,并不增强VSV病毒的复制能力,提示UFL1主要调控抗DNA病毒天然免疫反应。同样的,在L929细胞中敲除Ufl1后,双链脱氧核糖核苷酸模拟物诱导的IFN-β和IL-6表达也明显降低,提示Ufl1表达缺失抑制了DNA模拟物诱导的天然免疫反应。以上体外实验证明,E3连接酶UFL1可以正向调控抗病毒天然免疫。为了探究UFL1促进抗病毒天然免疫反应的机制,本课题通过双荧光素酶报告基因实验分析了UFL1在抗病毒天然免疫信号通路中的作用层次。结果表明,UFL1能有效提高c GAS及STING对IFN-β的诱导表达。随后,将原代巨噬细胞中UFL1表达敲低并使用HSV刺激,WB检测IRF3及NF-κB信号通路的活化情况,结果显示IKKβ、P65（NF-Kappa-B transcription factor P65）、TBK1以及IRF3的磷酸化水平均明显降低,这一实验结果提示UFL1表达降低抑制了IRF3及NF-κB信号通路的活化,并且其作用于IKKβ、TBK1的上游,即c GAS或STING。为了明确UFL1作用的靶分子,本课题进行了外源性及内源性免疫共沉淀实验并发现UFL1与STING具有相互作用,且荧光共聚焦实验也得到了相同的结果。以上实验结果表明,UFL1通过靶向STING调控c GAS-STING信号通路的活化。为了明确UFL1与STING相互作用能否调控RNA病毒诱导的天然免疫应答,本课题构建了Sting敲除的L929细胞,敲低UFL1的表达并使用VSV刺激,结果表明Sting缺失后UFL1的表达降低不能抑制VSV诱导的IFN-β、IL-6的表达,即UFL1通过靶向STING交叉调控抗RNA病毒天然免疫应答。为了进一步探究UFL1调控STING分子的具体机制,本课题分别检测了UFL1表达降低后STING分子m RNA和蛋白水平的变化。结果表明,敲低UFL1后STING的蛋白表达明显降低而m RNA表达没有明显变化。随后,通过在MEF细胞中共转STING与梯度剂量增加的UFL1,我们发现STING蛋白表达与UFL1转染剂量正相关。以上结果均提示UFL1可以影响STING蛋白水平的表达。鉴于生物体内蛋白质处于合成与降解的动态平衡状态,本课题在MEF细胞中过表达UFL1后分别使用蛋白合成抑制剂CHX（Cycloheximide）、蛋白降解抑制剂MG132及CQ（Chloroquine）处理以明确UFL1的作用途径。实验结果表明只有MG132可以逆转UFL1促进STING表达的效应。同时,在腹腔巨噬细胞中敲低UFL1表达后,通过加入以上三种抑制剂并检测STING的蛋白表达变化,发现MG132可以逆转STING蛋白降解的速率。以上实验均表明,UFL1可以抑制STING蛋白酶体途径降解。由于蛋白酶体途径降解主要受K48泛素化修饰调控,因此本课题检测了UFL1对STING分子泛素化修饰水平的影响。实验结果证明UFL1可以抑制STING分子K48泛素化修饰,并且Lys338、Lys347、Lys370是其作用的关键位点。进一步研究发现UFL1可以与另一E3连接酶TRIM29竞争性地结合STING,并减弱其对STING分子K48泛素化修饰水平,从而抑制STING蛋白酶体途径降解。综上所述,本课题发现了类泛素化家族E3连接酶UFL1可以正向调控抗DNA病毒天然免疫的新功能,找到了其作用的关键靶分子STING以及作用的关键位点,同时揭示了UFL1与TRIM29竞争性调节STING的新机制,进一步完善了STING表达与功能的调控网络,为抗病毒天然免疫提供了新的机制,也为相关疾病的治疗提供了新的靶点。