随着基因治疗研究的深入，转录靶向和酶解前体药策略成为肿瘤基因治疗的热点研究领域。现已有研究表明采用骨钙素启动子引导人单纯疱疹病毒胸苷激酶基因可以特异性杀伤骨肉瘤和骨肉瘤肺转移瘤。然而骨钙素启动子在多种非骨组织的低水平表达活性限制了该方法的临床应用。 随着对肿瘤细胞分子生物学特性研究的发展，端粒酶再激活已被公认为是参与肿瘤发生发展的关键步骤，同时端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子已被用做靶向转录启动子对多种肿瘤进行了基因治疗实验研究。为了进一步提高hTERT启动子在骨肉瘤细胞内的活性，根据实体肿瘤有缺氧环境这一特点以及成骨细胞特异性顺式作用元件2(OSE2)可以使异源最小启动子获得成骨细胞表达特异性，我们设计并构建了缺氧反应元件和OSE2的串联重复序列，在此基础之上获得了由这些转录调控元件修饰的hTERT核心启动子。 为了进一步评价这些修饰后的启动子活性定位及对骨肉瘤细胞的杀伤作用从而确定其临床应用价值，我们构建了由这些启动子引导荧光素酶和酵母源性胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的重组复制缺陷型腺病毒。 一、穿梭质粒与辅助质粒共转染HEK293细胞获得重组腺病毒 将由缺氧反应元件和OSE2的串联重复序列修饰后的hTERT核心启动子和荧光素酶基因或FCY1基因插入穿梭质粒并将其与辅助质粒共转染HEK293细胞，在转染后7-10天HEK293细胞均出现了典型的细胞病变反应，即细胞变圆、折光性增强并从培养板底脱落。 第四军医大学硕士学位论文二、PCR法鉴定重组复制缺陷型腺病毒DNA 从病毒培养上清中提取DNA后，采用自行设计的针对FCYI和荧光素酶基因的引物进行PCR，在FCYI组的8种重组病毒中均扩增出了122hp的目标片段，在荧光素酶组的 8种重组病毒中均扩增出了 31 Zbp的目标片段，证实获得了重组腺病毒。三、重组腺病毒的滴度测定 采用斑形成试验和终点稀释试验对扩增后的重组腺病毒滴度进行测定，虽然两种方法测定的结果不同，但并无数量级差异，证实我们获得了高滴度的重组腺病毒。四、RTPCR法鉴定重组腺病毒在A549细胞内的表达 用FCYI组病毒感染体外培养的端粒酶阳性A549细胞，提取RNA后用自行设计的 D．actin引物和 FCY引物进行 RT－PCR，结果显示同时扩增出了 185hp的卜actin目标片段和 122hp的FCYI目标片段，证实该组重组腺病毒均可在A549细胞内表达FCYI。 由缺氧反应元件和 OSEZ串联重复序列修饰后 hTERT核心启动子引导FCYI 和荧光素酶基因表达的重组复制缺陷型腺病毒的构建成功为评价缺氧反应元件、OSEZ以及hTERT核心启动子在骨肉瘤靶向转录基因治疗中的应用价值奠定了基础，为临床骨肉瘤基因治疗开辟了新思路。