奶牛机体在不同生理阶段时的基础代谢和氧化应激水平不同,理论上会导致免疫力的差异。明确不同生理阶段的青年奶牛、妊娠后期奶牛、产后健康奶牛、产后酮病奶牛和泌乳中期奶牛免疫水平的差异对预警和监测各阶段发生的疾病发生有着重要意义。围产期奶牛由于脂质代谢活动加强,易发生能量负平衡（negative energy balance,NEB）,引起血液中游离脂肪酸（non-esterified fatty acids,NEFA）的浓度激增,因此NEFA对围产期奶牛免疫状态的影响、炎症的发生起着至关重要的作用。中性粒细胞（Polymorphonuclear neutrophils,PMN）的功能与免疫力有着密切关系,PMN功能的受损会直接影响奶牛免疫力。PMN主要功能有吞噬、呼吸爆发和形成中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。本研究旨在研究不同生理阶段荷斯坦奶牛PMN受损导致的NETs形成是否有差异,并试图从NETs释放到细胞外的角度研究NEFA对NETs形成的机制。本研究采用改进的红细胞裂解法分离得到奶牛PMN,使用台盼蓝染色、姬姆萨染色对细胞进行活率和纯度鉴定;使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色;采用2’,7’-二氯荧光素二醋酸酯法（DCFH-DA）评估PMN中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的产生;采用SYTOX Orange荧光染色法观察NETs形态;采用Quant-i TTMPico Green ds DNA超敏核酸荧光染色法对产生的NETs进行量化;采用蛋白免疫印迹法（Western Blotting）对NETs组成相关蛋白和相关信号通路蛋白进行半定量测定;采用q PCR方法检测炎症因子和相关信号通路基因的m RNA表达。研究结果表明,通过对不同生理阶段的奶牛进行比较,妊娠后期奶牛PMN产生的ROS是青年奶牛的1.3倍（p＜0.01）。与青年奶牛相比,从泌乳中期和产后健康奶牛中分离得到的PMN产生的NETs相比于青年奶牛分别高出2.1和2.5倍（p＜0.01）。酮病奶牛PMN相比于其他阶段奶牛,能够产生更高水平的NETs和ROS,而青年奶牛PMN产生NETs和ROS量都较低。通过浓度梯度的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激青年奶牛中分离得到的PMN,发现ROS和NETs的产生呈浓度依赖性增加（R~2分别为0.96和0.86）。同样,用浓度梯度的佛波12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（Phorbol myristate 13-acetate,PMA）刺激青年奶牛PMN,发现刺激产生的ROS（R~2=0.99）和NETs（R~2=0.78）也呈浓度依赖性增加。NEFA可以刺激PMN产生NETs,这个过程伴随着细胞内ROS水平的升高。Western Blotting结果表明在NEFA作用下,NETs组成蛋白,包括组蛋白H3、弹性蛋白酶NE以及瓜氨酸化组蛋白H3的表达均显著升高;并伴随着PMN产生大量炎症因子,其中包括IL-6、IL-10、IL-18等,这可能是围产期奶牛发生炎症的重要代谢因素;Western Blotting结果也显示了PMN膜上成孔蛋白GSDMD和剪切后的N-GSDMD表达都升高,表明NETs形成机制与PMN膜上的成孔蛋白的表达有关,进而继续对GSDMD形成相关信号通路关键蛋白和基因包括NLRP3、NF-κB、Caspase1、Caspase4进行检测,显示这些重要信号分子的蛋白水平和m RNA表达水平均显著升高。由此得出结论:不同生理阶段奶牛由于体内的代谢不同,PMN功能也存在差异,最终形成NETs的能力也有一定差异;在浓度梯度的LPS或PMA刺激PMN生成NETs和ROS的量均呈线性增加,因此量化的结果表明与NETs和ROS产生与刺激物导致的感染炎症程度有关。NEFA能够诱导奶牛PMN产生NETs,伴随着PMN的炎症因子产生增多,因此NEFA可能也是引起奶牛围产期间奶牛代谢性炎症的原因之一。NEFA诱导产生NETs并释放到细胞外的机制与PMN细胞膜上成孔蛋白GSDMD表达量有关;这个过程是通过NF-κB--NLRP3-Caspase1/Caspase4--GSDMD/N-GSDMD信号通路介导。