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子宫内膜炎是家畜生殖系统的常见疾病,多发生于母畜分娩后,对动物的子宫内膜与卵巢造成损伤,使其发情和妊娠受到影响,导致动物繁殖障碍甚至死亡,严重危害畜牧业健康发展。致病微生物及其毒力因子,是造成子宫组织损伤、导致子宫内膜炎症反应的重要原因。化脓隐秘杆菌是引起家畜子宫内膜炎的主要致病菌之一,目前,由于缺乏有效疫苗,该菌感染的防治困难重重。深入揭示化脓隐秘杆菌的致病机制是研发该菌感染防控制剂的关键。细菌的神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）可裂解宿主体内糖结合物末端的神经氨酸残基,有助于菌体实现在宿主体内的定植、穿透和扩散,是细菌的重要毒力因子之一。该家族在化脓隐秘杆菌中共有2个成员,Nan H和Nan P,存在于菌体细胞壁外。目前对于化脓隐秘杆菌NA的研究较少,尚不清楚其对该菌毒力的影响。因此,深入探究Nan H和Nan P在化脓隐秘杆菌致病过程中的作用,对于进一步明确该菌引发子宫内膜炎的致病机制具有重要意义。本研究通过抑制化脓隐秘杆菌NA的活性,检测分析NanH和Nan P对该菌生长增殖、感染致病及生物被膜形成的影响;构建p ET-32a-nan H、p ET-32a-nan P重组原核表达载体,利用大肠杆菌表达系统获得重组蛋白;通过细胞学试验,分析Nan H、NanP刺激山羊子宫内膜上皮细胞（goat Endometrial Epithelial Cells,g EECs）发生炎性反应的作用,检测其与TLR4/NF-κB炎性信号通路间的关系,为深入揭示化脓隐秘杆菌引起山羊子宫内膜炎的分子机制奠定基础。主要试验结果如下:（1）使用奥司他韦酸抑制化脓隐秘杆菌NA的活性,通过绘制生长曲线发现,抑制NA对该菌的生长增殖无显著影响（p＞0.05）;通过结晶紫染色法发现,抑制NA后该菌的生物被膜形成速度显著减慢（p＜0.05）。使用NA受抑制与未受抑制的化脓隐秘杆菌分别感染gEECs,通过细胞裂解液菌落计数与免疫荧光技术发现,抑制NA后,菌体黏附、侵入g EECs的能力显著减弱（p＜0.05）,但其在g EECs胞内存活情况不受影响;通过q PCR技术发现,抑制NA会显著下调化脓隐秘杆菌引起的g EECs炎性基因IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-8的转录表达水平（p＜0.05）。（2）利用PCR技术克隆nanH、nanP基因,构建pET-32a-nan H、p ET-32a-nan P重组原核表达载体,诱导表达并纯化出具有NA活性的rNanH、rNanP重组蛋白。使用终浓度为1μg/m L的rNanH、2.5μg/m L的rNanP分别处理g EECs,q PCR与Western Blot结果显示,rNanH、rNanP的处理均可显著上调IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-8的转录表达水平（p＜0.05）,显著上调TLR4/NF-κB通路中TLR4、My D88、NF-κB的转录表达水平、TLR4的蛋白表达水平及NF-κB的p65亚基磷酸化水平（p＜0.05）,还可显著上调NLRP3、caspase-1的转录表达及NLRP3的蛋白表达（p＜0.05）;抑制NA活性可显著下调rNanH、rNanP对上述促炎细胞因子及信号通路的影响（p＜0.05）。说明Nan H和Nan P可分别通过g EECs中的TLR4/My D88/NF-κB通路以及NLRP3炎性小体的形成引发炎性反应。使用终浓度相同的rNanH、rNanP分别单独或联合处理g EECs,q PCR结果显示,与rNanH或rNanP单独处理组相比,联合处理组的IL-6、TNF-α、IL-1β及IL-8的转录水平均无显著变化（p＞0.05）,说明Nan H和Nan P无明显协同作用。使用1μmol/L的TAK-242特异性抑制g EECs TLR4的激活,并使用rNanH、rNanP分别处理,q PCR、Western Blot与免疫荧光结果显示,当TLR4受抑制后,显著封阻了rNanH、rNanP对g EECs的NF-κB及NLRP3相关炎性通路的影响（p＜0.05）。说明Nan H、Nan P能经TLR4识别,通过TLR4激活NF-κB,且该通路与NLRP3炎性小体的形成密切相关。综上,本研究表明NanH、NanP能够加强化脓隐秘杆菌对g EECs的黏附、侵入能力,加快该菌生物被膜的形成速度;Nan H、Nan P能经TLR4识别,激活TLR4/My D88/NF-κB炎性信号通路并促进下游的NLRP3炎性小体的形成,引起g EECs炎性反应,为揭示化脓隐秘杆菌引起子宫内膜炎的分子机制奠定基础。