研究背景及目的膀胱癌是全球第十大最常见的恶性肿瘤,在男性癌症发病率中排第六位,死亡率排第九位,发病率和死亡率均约为女性的4倍。膀胱癌最常见的病因包括基因突变、持续暴露于尿液排出的致癌物、长期暴露于烟草、香烟烟雾残留物和酒精,以及职业性接触石油产品、金属、油漆、化工染料和无机砷化合物等。膀胱癌目前可以分为非肌层浸润性膀胱癌以及肌层浸润性膀胱癌。其中非肌层浸润性膀胱癌局限于粘膜或粘膜下层,约占所有膀胱癌病例的75%,其最主要的治疗方法是经尿道电切术。但术后5年的复发率为3 1%～78%,术后5年进展率为0.8%～45%。因此术后膀胱内灌注卡介苗或膀胱内化疗,包括丝裂霉素、表阿霉素和吉西他滨等,对于预防复发和进展至关重要。肌层浸润性膀胱癌约占20%～25%,膀胱根治性切除术为主要治疗方法,术后5年的进展率约为50%。吉西他滨联合顺铂为肌层浸润性膀胱癌或转移性膀胱癌的标准化疗方案。吉西他滨属于广谱类的抗代谢物质,它是一种胞嘧啶类似物,可以诱导细胞周期阻滞及掩蔽链终止从而抑制DNA合成并导致细胞死亡。目前,吉西他滨是治疗膀胱癌、非小细胞肺癌和胰腺癌等恶性肿瘤的一线化疗的重要组成部分,但对于肌层浸润性膀胱癌或转移性膀胱癌的疾病缓解率仅为49%。此外,这些治疗策略可能导致严重的不良反应,包括恶心、呕吐、中性粒细胞减少、血小板减少、粘膜炎和发热性中性粒细胞减少症等,并且对于适用上述治疗的患者仍然容易出现复发和耐药性。因此,人们研究了一系列药物,目的是增强吉西他滨的作用并减少副作用。据报道,依维莫司、舒尼替尼、维生素C和维生素K3均能增强吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性。传统中医药在中国已具有悠久的应用历史,如今越来越多的中药衍生产品和草药也已经被证明具有生物活性甚至抗癌特性。小檗碱是一种异喹啉生物碱,可从黄连、小檗科、罂粟科等中草药物中分离出来。近年来发现它具有多种药理特性,包括抗炎、心血管保护、神经保护、抗高血糖、抗高脂血症、抗高血压和抗肿瘤作用。此外,小檗碱可对多种类型的肿瘤细胞产生细胞毒性,包括泌尿男生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、妇科肿瘤、肺癌、黑色素瘤等。先前的研究表明,小檗碱除了使膀胱癌细胞对表阿霉素敏感外,还可以通过抑制增殖、促进凋亡和细胞周期阻滞,对膀胱癌细胞产生抗肿瘤作用。DNA损伤通常在加速细胞死亡中发挥关键作用,而DNA双链断裂是最具细胞毒性的DNA损伤类型之一。DNA双链断裂之后,DNA修复系统迅速启动。Rad51重组酶是DNA同源重组修复的关键元件,被认为是介导维持基因组完整性的无错误修复机制。Rad51的高表达水平与许多肿瘤的侵袭性和治疗抗性有关,包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌和卵巢癌等,而Rad51的下调已被证明可提高化疗或放疗的敏感性。其他研究发现小檗碱和吉西他滨均可诱导DNA双链断裂,吉西他滨可在多种肿瘤中诱导Rad51表达上调,而小檗碱可在多种肿瘤中下调Rad51表达。因此,本研究假设小檗碱可以通过调节Rad51的表达使膀胱癌对吉西他滨敏感。本研究的目的是评估小檗碱对吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性的潜在影响,并探索其潜在机制,这可能是膀胱癌治疗的一种新型制剂或作用靶点。具体研究内容分以下三个部分:第一部分小檗碱增强吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性的体外研究研究背景和目的:虽然在临床上吉西他滨已被用于治疗膀胱癌多年,但严重的药物不良事件或耐药性经常发生。为增强患者对吉西他滨的敏感性并减少其副作用,相关药物的研究已经广泛开展。中医药作为中华民族特色,许多中草药已被证实具有抗肿瘤的作用,如槐耳、黄芩素、青藤碱、小檗碱等。为评估小檗碱对吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性的影响,本部分体外细胞实验,用吉西他滨和或小檗碱分别或联合处理膀胱癌细胞,开展相关研究。研究方法:选用人膀胱癌细胞系5637和T24进行培养,分别暴露于不同浓度的小檗碱或吉西他滨48小时或72小时,CCK-8法评估膀胱癌细胞活性。之后采用适当浓度的吉西他滨和小檗碱单独或联合处理细胞,采用CCK-8法评估膀胱癌细胞活性、采用流式细胞术检测膀胱癌细胞凋亡和细胞内活性氧产生、采用伤口愈合试验观察膀胱癌细胞迁移情况,以研究小檗碱对吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性的影响。研究结果:在两种细胞系中,小檗碱和吉西他滨均以时间和剂量依赖的方式抑制膀胱癌细胞增殖。吉西他滨和小檗碱联合用药组细胞活性显著低于吉西他滨组。小檗碱与吉西他滨单药治疗均增加了细胞凋亡率和细胞内活性氧生成水平,但与单独吉西他滨治疗后的细胞系相比,联合用药组治疗显著增加了细胞凋亡和细胞内活性氧生成水平。伤口愈合试验显示单药治疗和联合用药治疗均抑制了 5637和T24细胞的迁移能力,其中联合用药组的迁移率低于吉西他滨组。结论:小檗碱增强了吉西他滨对体外培养的膀胱癌细胞的细胞毒性,并且增强了吉西他滨诱导的细胞凋亡、活性氧生成和迁移抑制。第二部分小檗碱增强吉西他滨膀胱癌细胞毒性的分子机制研究研究背景和目的:网络数据库的不断发展,在医学研究中起到越来越重要的作用,通过网络数据库,找寻相关分子通路,再通过进一步的实验进行验证,可帮助我们明确相关结论。本部分通过网络数据库及相关通路及分子的细胞实验进行验证,以明确小檗碱增强吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性的分子机制。研究方法:使用Oncomine数据库和基因表达谱交互分析（GEPIA）检索Rad51重组酶mRNA表达的相关数据。单独或联合用药后使用Western blot检测Akt、p-Akt、Rad51的蛋白水平表达;使用RT-PCR检测Rad51 mRNA水平表达;使用PI3K抑制剂LY294002检测PI3K/Akt通路在吉西他滨膀胱癌细胞毒性中的影响;使用Rad51过表达质粒或特异性Rad51小干扰RNA检测Rad51在药物处理的膀胱癌细胞中的作用;通过转染myr-Akt质粒的回复实验,上调Akt的磷酸化水平,检测小檗碱诱导的吉西他滨细胞毒性增强和小檗碱诱导的膀胱癌细胞Rad51下调是否由PI3K/Akt途径介导。研究结果:根据Oncomine和GEPIA分析,与正常组织相比,膀胱癌组织中的Rad51表达显著上调,其中Rad51和Akt1表达之间存在正相关性（R=0.21;P＜0.05）。吉西他滨可诱导膀胱癌细胞中PI3K/Akt信号通路的激活及Rad51 mRNA和蛋白水平表达的上调,而小檗碱可以抑制吉西他滨诱导的PI3K/Akt信号通路激活和Rad51表达上调。敲除Rad51也可增强吉西他滨诱导的细胞毒性,而过表达Rad51可逆转小檗碱和吉西他滨诱导的细胞活性抑制。PI3K抑制剂LY294002或小檗碱均可使PI3K/Akt途径失活以增强吉西他滨诱导的细胞毒性并下调Rad51表达,而组成性活性Akt的过表达导致Akt磷酸化水平增高（代表PI3K/Akt通路的激活）可逆转小檗碱和吉西他滨联合作用导致的Rad51表达下降和细胞活性降低。结论:小檗碱可以通过抑制PI3K/Akt通路来下调Rad51的表达,从而增强吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性,这可能是膀胱癌治疗的一个新策略或新靶点。第三部分小檗碱增强吉西他滨抑制膀胱癌细胞增殖的体内研究研究背景和目的:体外实验与体内实验存在许多差异,所有药物的使用均应进行体内实验的验证。为验证小檗碱可增强吉西他滨诱导的膀胱癌毒性作用,本部分研究在体内实验条件下观察小檗碱对吉西他滨诱导的膀胱癌细胞毒性的影响。研究方法:将5637细胞皮下注射到小鼠侧腹,随机分为对照组、小檗碱组、吉西他滨组及联合用药组进行观察肿瘤增长情况,测量肿瘤的体积变化及最终重量,并通过测量异种移植肿瘤组织中的Ki67免疫组化染色程度来评估肿瘤中的细胞增殖活性。研究结果:在体内,与对照组相比,小檗碱组和吉西他滨组小鼠肿瘤的体积与重量均明显减小,而与吉西他滨组比较,联合用药组肿瘤体积与重量明显减小,差异具有统计学意义。免疫组化结果显示,与单独使用吉西他滨治疗的小鼠组织相比,联合用药组异种移植肿瘤中Ki67的表达水平显著降低。结论:体内实验的结果表明小檗碱增强了吉西他滨在膀胱癌中的抗增殖作用。