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目的：
乳腺癌是当今全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是女性恶性肿瘤死亡的主要原因。近年来，乳腺癌的发病率、致死率仍呈现不断上升的趋势，并且发病年龄也在呈现出年轻化方向发展的趋势。无论是在发达国家还是发展中国家，乳腺癌依旧是女性中最普遍的恶性肿瘤。早期中国的乳腺癌发病率相对较低，但是自从20世纪90年代以来，中国乳腺癌发病率的增长速度是全球乳腺癌发病率的两倍还要多，特别是在城市地区，乳腺癌己经成为威胁中国女性健康最为普遍的恶性肿瘤。近些年来，尽管在乳腺癌的诊断和治疗等方面都取得了相当不错的进展，使乳腺癌患者的总体生存率有了较大的改善，但是随着我国乳腺癌的发病人数逐年增加，有些类型乳腺癌的临床治疗效果仍不尽如人意，加之乳腺癌的复发和转移使乳腺癌更难彻底治愈。因此，研究乳腺癌增殖和转移的分子机制、寻找新的乳腺癌预防和诊断的分子标志物迫在眉睫。
长链非编码RNA（long non-codingRNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸非编码RNA分子。尽管已经标记的人类lncRNA数已经有数十万个，但其具体的功能仍有许多未知。近年来，越来越多的研究证实lncRNA参与许多生物学过程中的调控，比如基因表达、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤发生、发展、侵袭和转移等。近些年来的研究也表明，lncRNA的异常表达与许多人类癌症的发展和预后密切相关。因此以lncRNA为基础的诊断、治疗后续将为包括乳腺癌在内的肿瘤患者提供新的治疗靶点或诊断分子标志物。长基因间非编码RNA00641（long intergenic noncoding RNA00641，LINC00641）是一种新发现的lncRNA，近年有研究报道LINC00641在多种肿瘤中异常表达，LINC00641具有调控肿瘤细胞增殖，凋亡、迁移和侵袭的作用，与肿瘤患者的预后和生存相关。尽管这些研究表明LINC00641在多种的肿瘤中起着重要的作用，但是LINC00641在乳腺癌中的功能作用和潜在的分子机制仍然大量未知。为了探索LINC0064在乳腺癌中的表达、生物学功能及其对乳腺癌发展调控的初步机制，本研究包括以下三个部分：第一部分LINC00641在乳腺癌组织的表达与临床病理特征的关系；第二部分：过表达LINC00641对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；第三部分：LINC00641作用机理的初步分析。
第一部分 LINC00641在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系
方法：
（1）生物信息学方法“TANRIC”和“GEPIA”预测分析LINC00641在乳腺癌组织中的表达情况。
（2）收集106例乳腺癌患者癌组织标本及相对应的癌旁正常乳腺组织标本。利用qRT-PCR测定临床组织样本中LINC00641相对表达水平，并分析其表达水平与乳腺癌患年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期的相关性。
结果：
（1）生物信息学方法“TANRIC”和“GEPIA”预测分析结果均表明LINC00641在乳腺癌组织样本中低表达（P＜0.05）。
（2）qRT-PCR测定结果显示与癌旁组织相比，乳腺癌组织样本中LINC00641相对表达水平显著下调（P＜0.05）。qRT-PCR结果和“TANRIC”和“GEPIA”预测分析结果一致，这也说明生物信息学预测结果具有可靠性。乳腺癌组织中LINC00641相对表达水平与患者的年龄无关（P＞0.05），但与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期显著相关（P＜0.05）。
第二部分 过表达LINC00641对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
方法：
（1）qRT-PCR测定人乳腺癌细胞（BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231）以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中LINC00641相对表达水平。构建过表达LINC00641载体和空载体感染对数期生长的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231，qRT-PCR测定过表达LINC00641的MCF-7和MDA-MB-231细胞中的LINC00641相对表达水平。
（2）CCK-8实验检测MCF-7和MDA-MB-231中两组细胞增殖能力。利用流式细胞分析技术检测两组细胞的周期和凋亡比例。Transwell细胞迁移和侵袭实验分别检测两组细胞的迁移和侵袭能力。
结果：
（1）与MCF-10A细胞相比，BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231细胞中LINC00641相对表达水平均显著下调（P＜0.05），而在MCF-7和MDA-MB-231中细胞LINC00641相对表达水平下调最显著，所以采用MCF-7和MDA-MB-231细胞进行后续实验。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染过表达LINC00641载体能够显著上调细胞中LINC00641的相对表达水平。
（2）CCK-8实验表明与转染NC组相比，转染LINC00641的MCF-7和MDA-MB-231细胞在转染48、72小时的生长速度显著下降（P＜0.05）。流式细胞周期和凋亡实验表明与转染NC组相比，转染LINC00641组MCF-7和MDA-MB-231细胞G1期细胞比例增加（P＜0.05）、S期细胞比例减少（P＜0.05）、
G2期细胞比例无影响（P＞0.05），细胞凋亡比例增加（P＜0.05）。Transwell细胞迁移和侵袭实验表明与转染NC组相比，转染LINC00641组MCF-7和MDA-MB-231细胞发生迁移和侵袭的数目均显著减少（P＜0.05）。
第三部分 LINC00641作用机理的初步分析
方法：
（1）生物信息学预测与LINC00641相互作用的miRNA，并通过双荧光素酶报告基因检测实验验证LINC00641与miRNA直接相互作用。
（2）qRT-PCR测定乳腺癌组织和癌旁正常乳腺癌组织中miR-194-5p相对表达水平，并利用皮尔逊相关系数分析miR-194-5p与LINC00641表达水平相关性。
（3）qRT-PCR测定人乳腺癌细胞（BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231细胞）、人正常乳腺细胞MCF-10A、过表达LINC00641+miR-NC的MCF-7或MDA-MB-231细胞（LINC00641+miR-NC）、过表达LINC00641+miR-194-5p mimic的MCF-7和MDA-MB-231细胞（LINC00641+miR-194-5p）中miR-194-5p的表达水平。
(4)分别将过表达LINC00641载体+miR-194-5p mimic（LINC00641+miR-194-5p）和过表达LINC00641载体+miR-NC（LINC00641+miR-NC）转染MCF-7和MDA-MB-231细胞。进行CCK-8实验、流式细胞周期和凋亡实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验，检测细胞的增殖能力、周期和凋亡比例、迁移和侵袭能力。
结果：
（1）生物信息学预测分析结果显示LINC00641与miR-194-5p存在潜在的特异结合位点，双荧光素酶报告实验表明LINC00641可以直接与miR-194-5p结合。
（2）与癌旁组织样本相比，乳腺癌组织样本中miR-194-5p相对表达水平显著上调（P＜0.05）。在乳腺癌组织样本中miR-194-5p和LINC00641表达水平呈现显著的负相关性，相关系数r为-0.676（P＜0.05）。
（3）与MCF-10A细胞相比，BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231细胞中miR-194-5p相对表达水平均显著上调（P＜0.05）。与LINC00641+miR-NC相比，转染LINC00641的MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-194-5p相对表达水平均显著下调（P＜0.05），而同时转染LINC00641+miR-194-5p的MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-194-5p表达上调。
（4）与转染LINC00641+miR-NC组相比，LINC00641+miR-194-5p组促进细胞增殖（P＜0.05）；细胞G1期细胞比例减少（P＜0.05）、S期细胞比例增加（P＜0.05）、G2期细胞比例无影响（P＞0.05）；抑制细胞凋亡并促进细胞迁移和侵袭（P＜0.05）。
结论：
（1）LINC00641在乳腺癌组织中显著下调，且LINC00641表达与乳腺癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期显著相关，而与患者年龄无关。
（2）LINC00641在乳腺癌细胞系中显著下调，且在体外过表达LINC00641可以抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进乳腺癌细胞凋亡；在体内过表达LINC00641可抑制裸鼠体内移植肿瘤的生长和肺转移。
（3）LINC00641通过海绵吸附miR-194-5p抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，有望成为乳腺癌治疗新的潜在靶点。
乳腺癌是当今全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，也是女性恶性肿瘤死亡的主要原因。近年来，乳腺癌的发病率、致死率仍呈现不断上升的趋势，并且发病年龄也在呈现出年轻化方向发展的趋势。无论是在发达国家还是发展中国家，乳腺癌依旧是女性中最普遍的恶性肿瘤。早期中国的乳腺癌发病率相对较低，但是自从20世纪90年代以来，中国乳腺癌发病率的增长速度是全球乳腺癌发病率的两倍还要多，特别是在城市地区，乳腺癌己经成为威胁中国女性健康最为普遍的恶性肿瘤。近些年来，尽管在乳腺癌的诊断和治疗等方面都取得了相当不错的进展，使乳腺癌患者的总体生存率有了较大的改善，但是随着我国乳腺癌的发病人数逐年增加，有些类型乳腺癌的临床治疗效果仍不尽如人意，加之乳腺癌的复发和转移使乳腺癌更难彻底治愈。因此，研究乳腺癌增殖和转移的分子机制、寻找新的乳腺癌预防和诊断的分子标志物迫在眉睫。
长链非编码RNA（long non-codingRNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸非编码RNA分子。尽管已经标记的人类lncRNA数已经有数十万个，但其具体的功能仍有许多未知。近年来，越来越多的研究证实lncRNA参与许多生物学过程中的调控，比如基因表达、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤发生、发展、侵袭和转移等。近些年来的研究也表明，lncRNA的异常表达与许多人类癌症的发展和预后密切相关。因此以lncRNA为基础的诊断、治疗后续将为包括乳腺癌在内的肿瘤患者提供新的治疗靶点或诊断分子标志物。长基因间非编码RNA00641（long intergenic noncoding RNA00641，LINC00641）是一种新发现的lncRNA，近年有研究报道LINC00641在多种肿瘤中异常表达，LINC00641具有调控肿瘤细胞增殖，凋亡、迁移和侵袭的作用，与肿瘤患者的预后和生存相关。尽管这些研究表明LINC00641在多种的肿瘤中起着重要的作用，但是LINC00641在乳腺癌中的功能作用和潜在的分子机制仍然大量未知。为了探索LINC0064在乳腺癌中的表达、生物学功能及其对乳腺癌发展调控的初步机制，本研究包括以下三个部分：第一部分LINC00641在乳腺癌组织的表达与临床病理特征的关系；第二部分：过表达LINC00641对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；第三部分：LINC00641作用机理的初步分析。
第一部分 LINC00641在乳腺癌组织中的表达与临床病理特征的关系
方法：
（1）生物信息学方法“TANRIC”和“GEPIA”预测分析LINC00641在乳腺癌组织中的表达情况。
（2）收集106例乳腺癌患者癌组织标本及相对应的癌旁正常乳腺组织标本。利用qRT-PCR测定临床组织样本中LINC00641相对表达水平，并分析其表达水平与乳腺癌患年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期的相关性。
结果：
（1）生物信息学方法“TANRIC”和“GEPIA”预测分析结果均表明LINC00641在乳腺癌组织样本中低表达（P＜0.05）。
（2）qRT-PCR测定结果显示与癌旁组织相比，乳腺癌组织样本中LINC00641相对表达水平显著下调（P＜0.05）。qRT-PCR结果和“TANRIC”和“GEPIA”预测分析结果一致，这也说明生物信息学预测结果具有可靠性。乳腺癌组织中LINC00641相对表达水平与患者的年龄无关（P＞0.05），但与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期显著相关（P＜0.05）。
第二部分 过表达LINC00641对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响
方法：
（1）qRT-PCR测定人乳腺癌细胞（BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231）以及正常乳腺上皮细胞系MCF-10A中LINC00641相对表达水平。构建过表达LINC00641载体和空载体感染对数期生长的乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231，qRT-PCR测定过表达LINC00641的MCF-7和MDA-MB-231细胞中的LINC00641相对表达水平。
（2）CCK-8实验检测MCF-7和MDA-MB-231中两组细胞增殖能力。利用流式细胞分析技术检测两组细胞的周期和凋亡比例。Transwell细胞迁移和侵袭实验分别检测两组细胞的迁移和侵袭能力。
结果：
（1）与MCF-10A细胞相比，BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231细胞中LINC00641相对表达水平均显著下调（P＜0.05），而在MCF-7和MDA-MB-231中细胞LINC00641相对表达水平下调最显著，所以采用MCF-7和MDA-MB-231细胞进行后续实验。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中转染过表达LINC00641载体能够显著上调细胞中LINC00641的相对表达水平。
（2）CCK-8实验表明与转染NC组相比，转染LINC00641的MCF-7和MDA-MB-231细胞在转染48、72小时的生长速度显著下降（P＜0.05）。流式细胞周期和凋亡实验表明与转染NC组相比，转染LINC00641组MCF-7和MDA-MB-231细胞G1期细胞比例增加（P＜0.05）、S期细胞比例减少（P＜0.05）、
G2期细胞比例无影响（P＞0.05），细胞凋亡比例增加（P＜0.05）。Transwell细胞迁移和侵袭实验表明与转染NC组相比，转染LINC00641组MCF-7和MDA-MB-231细胞发生迁移和侵袭的数目均显著减少（P＜0.05）。
第三部分 LINC00641作用机理的初步分析
方法：
（1）生物信息学预测与LINC00641相互作用的miRNA，并通过双荧光素酶报告基因检测实验验证LINC00641与miRNA直接相互作用。
（2）qRT-PCR测定乳腺癌组织和癌旁正常乳腺癌组织中miR-194-5p相对表达水平，并利用皮尔逊相关系数分析miR-194-5p与LINC00641表达水平相关性。
（3）qRT-PCR测定人乳腺癌细胞（BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231细胞）、人正常乳腺细胞MCF-10A、过表达LINC00641+miR-NC的MCF-7或MDA-MB-231细胞（LINC00641+miR-NC）、过表达LINC00641+miR-194-5p mimic的MCF-7和MDA-MB-231细胞（LINC00641+miR-194-5p）中miR-194-5p的表达水平。
(4)分别将过表达LINC00641载体+miR-194-5p mimic（LINC00641+miR-194-5p）和过表达LINC00641载体+miR-NC（LINC00641+miR-NC）转染MCF-7和MDA-MB-231细胞。进行CCK-8实验、流式细胞周期和凋亡实验、Transwell细胞迁移和侵袭实验，检测细胞的增殖能力、周期和凋亡比例、迁移和侵袭能力。
结果：
（1）生物信息学预测分析结果显示LINC00641与miR-194-5p存在潜在的特异结合位点，双荧光素酶报告实验表明LINC00641可以直接与miR-194-5p结合。
（2）与癌旁组织样本相比，乳腺癌组织样本中miR-194-5p相对表达水平显著上调（P＜0.05）。在乳腺癌组织样本中miR-194-5p和LINC00641表达水平呈现显著的负相关性，相关系数r为-0.676（P＜0.05）。
（3）与MCF-10A细胞相比，BCAP-37、MDA-MB-453、UACC-812、MCF-7、MDA-MB-231细胞中miR-194-5p相对表达水平均显著上调（P＜0.05）。与LINC00641+miR-NC相比，转染LINC00641的MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-194-5p相对表达水平均显著下调（P＜0.05），而同时转染LINC00641+miR-194-5p的MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-194-5p表达上调。
（4）与转染LINC00641+miR-NC组相比，LINC00641+miR-194-5p组促进细胞增殖（P＜0.05）；细胞G1期细胞比例减少（P＜0.05）、S期细胞比例增加（P＜0.05）、G2期细胞比例无影响（P＞0.05）；抑制细胞凋亡并促进细胞迁移和侵袭（P＜0.05）。
结论：
（1）LINC00641在乳腺癌组织中显著下调，且LINC00641表达与乳腺癌患者的肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期显著相关，而与患者年龄无关。
（2）LINC00641在乳腺癌细胞系中显著下调，且在体外过表达LINC00641可以抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进乳腺癌细胞凋亡；在体内过表达LINC00641可抑制裸鼠体内移植肿瘤的生长和肺转移。
（3）LINC00641通过海绵吸附miR-194-5p抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，有望成为乳腺癌治疗新的潜在靶点。