前言人表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)过表达的乳腺癌,约占整个乳腺癌的20-25%。在乳腺癌分子分型中,此型患者容易出现疾病进展,属于预后较差的类型,因此死亡率相对较高。首个在国际上批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的药物赫赛汀,是一种人源化单克隆抗体,可以与HER2胞外段Ⅳ区特异性结合,阻断下游信号的发生。自上市以来,赫赛汀明显延长了HER2阳性乳腺癌患者的无病生存期和总生存期,临床缓解率也显著提高。我们对临床晚期复发转移的病例,应用赫赛汀治疗也有显著疗效[1]。因此,赫赛汀被美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南推荐用于HER2阳性乳腺癌的治疗。然而,在临床治疗中发现仍有许多亟待解决的问题。最突出的就是赫赛汀耐药现象[2]和心脏毒性[3]。在临床上,仅不足35%的HER2过表达乳腺癌患者对赫赛汀单药治疗有效,大部分初始有效的患者在治疗期间(12个月)发生耐药。由于缺乏可靠的评价赫赛汀耐药性的分子标志物,使得一部分患者正在接受低效甚至无效治疗,既造成经济损失又延误病情。另外部分患者治疗期间出现不可耐受的心脏毒性,如心肌受损,射血分数降低,表现为心慌、胸闷、胸痛、呼吸困难等临床症状[4],而被迫中止治疗。因此,如何预测乃至克服赫赛汀的耐药,预防其心脏毒性,成为赫赛汀临床治疗迫切需要解决的问题。胰岛素样生长因子1受体(Insulin like growth factor 1 receptor,IGF1R)属跨膜的酪氨酸激酶受体。大量的实验证实,IGF1R激活后可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。很多肿瘤中发现IGF1R过表达和异常激活,其下游PI3K/AKT信号通路的异常激活常常合并有赫赛汀耐药的发生[5]。转染IGF1R进入赫赛汀敏感的SKBR3细胞会导致耐药发生。获得性赫赛汀耐药细胞株BT474/HER模型中,细胞IGF1R表达水平是亲代BT474细胞的3倍以上[6]。应用IGF1R抗体α-IR3或者针对IGF1R的小分子干扰RNA以及IGF1R酪氨酸激酶抑制剂抑制IGF1R的激活,均可使细胞对赫赛汀的反映性增加,并能恢复耐药细胞SKBR3对赫赛汀的敏感性[7]。PI3K/AKT信号通路是IGF1R与HER2共同的下游信号通路,其下游信号蛋白分子,如胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1,IRS1)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)异常激活以及抑癌基因PTEN的失活,对细胞的增殖和凋亡具有重要影响,IGF1R可能正是通过该条通路影响着细胞对赫赛汀的反应性。目前,对于IGF1R与HER2的相互作用方式,以及PI3K/AKT信号通路对赫赛汀敏感性的影响,其机制尚不完全清楚。当前从天然植物中寻找抗肿瘤的有效成分是肿瘤研究的热点。纯天然成分二氢杨梅素是从藤茶类植物中提取而成,隶属于黄酮类化合物,具备抗氧化、抗血栓、护肝、消炎等多种功效[8]。最近研究发现,二氢杨梅素还具备抗肿瘤的功效,能够抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡[9]。联合化疗药物应用时,可以增强化疗药物抗肿瘤作用,并能够减轻化疗造成的骨髓、肝、肾损害。二氢杨梅素是否可以增加赫赛汀治疗的敏感性以及减轻由赫赛汀治疗造成的心肌损害,尚未见文献报道。目前对二氢杨梅素在抗肿瘤方面的研究,才刚刚兴起,国内外文献报道较少。屠呦呦教授从植物中提取青蒿素,并获得今年的诺贝尔医学奖,把蕴含着我们伟大民族的无穷智慧的中医药带向了世界舞台。藤茶类植物在我国分布广泛、资源丰富,为二氢杨梅素的提取和研究提供了可靠保障。如何将具有悠久的历史和文化底蕴中医药与现代文明的西医药结合起来,取长补短,共同开发,是我们今后研究的重要内容之一。本课题拟通过赫赛汀诱导人乳腺癌SKBR3细胞,培养稳定传代的耐药SKBR3-R细胞株并建立人乳腺癌SKBR3-R细胞稳转株裸鼠移植瘤模型。通过观察SKBR3和SKBR3-R细胞中IGF1R及HER2的表达及相互作用,以及PI3K/AKT信号通路中IRS1,AKT,PTEN等的表达和激活水平,探讨IGF1R/HER2介导的PI3K/AKT信号通路在抗HER2治疗耐药发生过程中起的作用。进一步比较赫赛汀及其联合二氢杨梅素的抗肿瘤疗效,探讨二氢杨梅素对赫赛汀治疗敏感性以及对心、肝毒性的影响,阐明PI3K/AKT信号通路在其中起的作用。探讨二氢杨梅素联合靶向治疗的价值和意义。第一部分:二氢杨梅素通过抑制IGF1R/HER2下游信号途径增强赫赛汀耐药SKBR3细胞对赫赛汀的敏感性目的:1.探讨经赫赛汀诱导的SKBR3细胞耐药株SKBR3-R细胞膜受体分子IGF1R、HER2的相互作用及对下游细胞信号的影响;2.探讨IGF1R介导的信号通路对SKBR3细胞赫赛汀敏感性的影响;3.探讨二氢杨梅素对SKBR3-R细胞赫赛汀敏感性影响及可能机制。方法:1.赫赛汀诱导培养建立对耐药的SKBR3-R细胞株;2.Western blot检测细胞受体分子IGF1R、HER2及下游信号蛋白IRS1、AKT、MAPK、PTEN表达及磷酸化水平;3.免疫沉淀法检测细胞IGF1R和HER2蛋白分子间相互作用;4.MTT法测定细胞增殖及细胞活性;5.流式细胞仪测定细胞周期及细胞凋亡。结果:1.由SKBR3细胞经赫赛汀诱导培养获得稳定传代的耐药株SKBR3-R细胞,细胞周期分布发生明显改变,分布在S期的SKBR3-R细胞占比是SKBR3细胞的3倍,分布在G2-M期的SKBR3细胞占比是SKBR3-R细胞的3-4倍;2.对SKBR3-R细胞的裂解产物行IGF1R抗体免疫沉淀,沉淀物中有HER2蛋白的存在,反之亦然。而SKBR3细胞中并未有此现象发生。3.二氢杨梅素作用SKBR3及SKBR3-R细胞后,细胞增殖能力均受到抑制,且随着二氢杨梅素作用浓度升高,细胞抑制程度增加。4.随IGF1作用时间延长,SKBR3细胞内IGF1R/HER2二聚体含量轻度增加,IGF1R磷酸化水平升高,HER2磷酸化水平轻微下降。而SKBR3-R细胞内二聚体含量无明显影响,但IGF1R磷酸化速度更快,HER2磷酸化水平也逐渐升高。两组细胞内下游信号分子IRS1磷酸化水平均逐渐升高,PTEN蛋白表达量均逐渐下降,AKT及MAPK磷酸化水平则表现为先升高后降低,在SKBR3-R细胞内上述现象表现的更加明显。5.α-IR3作用SKBR3-R细胞后,细胞内IGF1R/HER2二聚体含量显著降低(p<0.05),并且IGF1R磷酸化水平显著降低(p<0.05),但HER2磷酸化水平未见明显变化。下游信号蛋白IRS1、AKT、MAPK磷酸化水平均逐渐减弱,而PTEN表达水平维持不变。α-IR3及Herceptin分别作用SKBR3-R细胞时,对细胞增殖抑制程度较弱,联合作用时,SKBR3-R细胞增殖能力显著下降(p<0.05)。6.随二氢杨梅素作用浓度升高,SKBR3及SKBR3-R细胞中,IGF1R磷酸化水平均有降低,后者较前者降低的幅度更为明显。二氢杨梅素可降低SKBR3-R细胞中HER2的磷酸化水平,但对SKBR3细胞HER2磷酸化水平影响不明显。另外,两组细胞IGF1R及HER2总体水平表达无显著差异。经二氢杨梅素预处理过后再经赫赛汀处理的SKBR3-R细胞,细胞内IGF1R及HER2磷酸化水平较赫赛汀单药作用组显著降低(p<0.05),IGF1R磷酸化水平降低更加明显。赫赛汀组信号蛋白IRS1、AKT、MAPK磷酸化水平变化不明显,对赫赛汀的敏感性较差。经二氢杨梅素预处理过后,细胞对赫赛汀的敏感性明显增强,IRS1、AKT磷酸化水平降低,但MAPK磷酸化水平无明显变化。经二氢杨梅素作用过后的细胞,PTEN表达量显著上升(p<0.05)。7.经二氢杨梅素预处理过后的SKBR3及SKBR3-R细胞,对赫赛汀的敏感性显著增强,细胞凋亡率明显增加,尤其在SKBR3-R细胞表现得更加明显。(p<0.05)。结论:1.HER2过表达乳腺癌细胞内IGF1R/HER2二聚体形成,是造成赫赛汀耐药的重要原因之一;抑制IGF1R/HER2二聚体形成,可恢复细胞对赫赛汀的敏感性。2.二氢杨梅素能够抑制IGF1R/HER2二聚体形成和激活,阻断下游IRS1/PI3K/AKT信号通路传递,促进抑癌基因PTEN表达,显著提高SKBR3-R细胞对赫赛汀的敏感性。第二部分:二氢杨梅素对SKBR3-R细胞移植瘤小鼠体内赫赛汀敏感性的影响目的:1.观察二氢杨梅素对SKBR3-R细胞裸鼠移植瘤赫赛汀敏感性的影响。2.观察二氢杨梅素对PI3K/AKT细胞信号通路的影响。3.观察二氢杨梅素对裸鼠心、肝功能的影响。4.观察二氢杨梅素联合赫赛汀治疗对裸鼠循环肿瘤细胞(CTC)的影响。方法:1.建立SKBR3-R细胞裸鼠移植瘤模型,建模成功后取状态良好、体重相近的裸鼠随机分组,分别为对照组(NS)、赫赛汀组(H)、二氢杨梅素组(D)、赫赛汀+二氢杨梅素组(H+D)。每组6只,共24只,实验周期21天。2.每间隔3-4天,卡尺量各实验组裸鼠肿瘤长、短径,记算并记录肿瘤体积,天平称各实验组裸鼠质量并记录。3.第21日,处死各实验组裸鼠,取血,全自动生化分析仪检测LDH、CK、ALT、AST水平。4.Western blot测实验组裸鼠肿瘤组织中PTEN、AKT、p-AKT、IRS1、p-IRS1表达水平。5.免疫组织化学检测裸鼠肿瘤组织中HER2、IGF1R、p-AKT、p-IRS1、PTEN表达水平。6.阴性富集技术分离和收集裸鼠循环肿瘤细胞(CTC),通过免疫荧光技术(im FISH)分析鉴定CTC。结果:1.实验周期为21天,全程无裸鼠死亡。各组裸鼠在实验周期内体重升降不等,NS组裸鼠体重呈上升走势,治疗组均呈下降走势。总体差异不显著(p>0.05)。2.实验周期内各实验组裸鼠肿瘤体积均逐渐增大,(H+D)组瘤体增大程度低于(NS)组,差异具有显著性(p<0.05)。3.治疗结束时,(H)组裸鼠血清LDH、CK、ALT、AST水平均有所上升,其中LDH上升较为明显;(H+D)组血清LDH、CK、ALT、AST水平较(H)组降低,差异具有显著性(p<0.05)。4.(H)组裸鼠肿瘤组织PTEN、p-IRS1水平与(NS)对照组无显著差异(p>0.05),(H+D)组肿瘤组织中PTEN表达增加,p-IRS1水平降低,差别均有显著性(p<0.01,p<0.05)。治疗组肿瘤组织中p-AKT水平较对照组均下降,(H+D)组较(H)组降低更为明显,差异具有显著性(p<0.05)。总HER2、IGF1R、AKT、IRS1表达水平各组间均无显著差异(p>0.05)。5.(H+D)组较(NS)对照组血清CTC数量减少,差异具有显著性(p<0.05)。结论:1.二氢杨梅素能够提高裸鼠SKBR3-R细胞移植瘤对赫赛汀的敏感性。2.二氢杨梅素对裸鼠的心、肝功能有一定的保护作用。3.二氢杨梅素可以抑制肿瘤细胞PI3K/AKT信号传导通路的异常激活。4.二氢杨梅素联合赫赛汀治疗可显著降低裸鼠血清CTC数量,降低肿瘤转移复发的风险。