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生物催化α-酮戊二酸(2-KG)为L-谷氨酸(Glu)的反应在有机合成及检测试剂领域有重要的应用前景。目前鲜有研究生物催化2-KG为Glu的报道,实现该反应的关键是找到性质优良的谷氨酸脱氢酶(GDH)并实现酶制剂的高效低成本生产。本研究首先依据文献报道的产GDH野生菌菌种信息和NCBI数据库对GDH 进行筛选,化学合成了 BsuGDH、PenGDH、AxyGDH、CsyGDH、CdiGDH、TenGDH六种GDH编码基因,并构建于pET-28a(+)质粒上,再将质粒转化进E.coli BL21(DE3)感受态中成功构建出产酶工程菌。通过对产酶工程菌摇瓶发酵后的酶蛋白可溶性表达、粗酶液酶活、粗酶液热稳定性等因素的比较,筛选得到了可溶性表达好、比酶活高的谷氨酸脱氢酶AxyGDH。随后对AxyGDH的酶学性质进行了表征,发现其最适温度为60℃、最适pH为8.0,在该条件下比酶活达到903.1±24.6 U/mg,酶活半衰期为167 h。同时研究了底物2-KG和NH4+以及常见的金属离子对酶活力的影响,随着反应中底物2-KG和NH4+浓度的提高,酶的催化活力先升后降,分别在2-KG浓度为10 mmol/L、NH4+浓度为250mmol/L时酶的催化活力达到最高;发现本实验所选择的金属离子都会抑制酶的催化活性。然后对AxyGDH催化2-KG为Glu的反应条件进行研究。在AxyGDH和葡萄糖脱氢酶(GLDH)双酶耦合催化2-KG为Glu的反应体系中,基于AxyGDH的酶学性质设计实验探究反应条件。测得最适反应温度为40℃、pH为8.0,酶活添加比例为1:2(AxyGDH:GLDH),氨基供体NH4+与底物2-KG的添加比为1:1(mol/mol),葡萄糖与底物2-KG的添加比为1.25:1(mol/mol)。在最适反应条件下,当初始底物2-KG的浓度为10 mmol/L时,添加0.04 mmol/LNAD+、1 U/mL AxyGDH和2 U/mL GLDH,反应28min后底物完全转化。最后对表达AxyGDH的工程菌E.coli(DE3)/pET-28a(+)-AxyGDH进行产酶发酵条件优化。先优化了基本的诱导产酶条件,确定诱导起始OD600为1.2,诱导剂IPTG浓度为0.7 mmol/L,诱导温度为25℃,诱导时间为24 h;再通过单因素碳、氮源优化和响应面培养基组分优化确定最适培养基配方为:甘油11.3 g/L,安琪酵母粉 16.3 g/L,MgS04·7H20 0.62 g/L,Na2HP04·12H20 17.1 g/L,KH2P043g/L,NH4Cl 1.5 g/L,NaCl 0.5 g/L;在10L发酵罐中对工程菌进行补料分批高密度发酵过程优化,优化了诱导前的比生长速率,控制比生长速率为0.20h-1时发酵效果最好,此时获得的细胞干重为44.8 g/L,所得谷氨酸脱氢酶发酵酶活为9066±45 U/mL,是LB摇瓶发酵酶活的51.1倍,极大地降低了谷氨酸脱氢酶的生产成本,为工业化生产谷氨酸脱氢酶提供了一定的参考。