线粒体基因组(mitochondrial genome, mtDNA)具有基因数目少、多态性显著、进化速率快、母系遗传以及缺乏重组等特点,是研究基因组结构、功能与进化的良好模型,同时也是研究生物分子分类、系统进化、群体遗传及变异等方面的理想分子标记。贝蛔属(Baylisascaris)蛔虫是野生哺乳类动物体内最常见的一类肠道寄生性线虫,感染普遍,危害极大。其中,西氏贝蛔虫(Baylisascaris schroederi)作为大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的一种特异寄生线虫,是导致野生大熊猫死亡的主要原发性和继发性病因之一；而小熊猫贝蛔虫(Baylisascaris ailuri)则是导致野生小熊猫(Ailurus fulgens)死亡的一个重要原因；转移贝蛔虫(Baylisascaris transfuga)和浣熊贝蛔虫(Baylisascaris procyonis)分别作为熊科(Ursidae)动物和浣熊(Procyon lotor)体内的一种常见寄生性线虫,其移行期幼虫在包括人在内的多种非宿主动物体内所引起的眼睛幼虫移行症(OLM)、内脏幼虫移行症(VLM)以及神经幼虫移行症(NLM)已经使得两者成为全球潜在的、重要的人畜共患寄生性蠕虫。尽管四种贝蛔虫有着重要的兽医和公共卫生健康意义,但目前就它们的流行病学、分子生态学以及种群遗传学等特征而言,仍知之甚少。线粒体基因组的研究能为我们进行这些蛔虫生态学以及流行病学调查提供良好的物质基础,从而有益与我们更好的预防和控制这类贝蛔虫病(baylisascariasis)。为此,本研究中采用Long-PCR扩增(Long Polymerase Chain Reaction, Long-PCR)与引物步移(Primer-walking)相结合的法对上述四种贝蛔虫的线粒体基因组全序列进行了测定。通过参照猪蛔虫(Ascaris suum)、犬弓蛔虫(Toxocara canis) mtDNA信息完成了四条线粒体基因组全序列的拼接和注释工作,并结合相关物种全序列的信息,进行了包括基因组结构组成、碱基成分、蛋白质密码了使用偏好以及tRNA、rRNA和非编码二级结构预测与比较在内的综合性分析。此外,本研究还根据己公开的蛔目线粒体基因组和本实验室己测定的物种,对蛔目线虫的系统发育关系进行了重建。主要研究工作和结果如下：1.西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫及转移贝蛔虫线粒体全基因组研究1.1西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫、转移贝蛔虫mtDNAs全长分别为14,778bp、14,657bp、14,898bp,整个基因组均包含36个基因,即12个蛋白质编码基因基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因以及两段非编码的序列(AT-rich区和NCR)。与尾感器亚纲的其他物种相比较,3种贝蛔虫的基因排列顺序(包括非编码区)与蛔目线虫(如猪蛔虫和犬弓蛔虫)的排列顺序一致,而与旋尾目线虫(如犬恶丝虫和旋盘尾丝虫)的差异较大。1.2西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫和转移贝蛔虫mtDNAs,总的AT含量分别为68.62%、69.47%和69.45%,使整个基因组具有明显的AT偏好；但与蛔目的其它线虫线粒体基因组相比,三种贝蛔虫的AT含量仍属于最低的一类。在密码子使用上,三种贝蛔虫以TTG、 ATT、GTG和ATG作为其12个蛋白质编码基因翻译起始密码子,而以TAG、TAA以及T和TA(不完整终止密码子)作为翻译终止密码子；另外,在所有密码子的使用中,TTT (Phe)密码子的使用频率最高,而CTC (Leu)密码子使用频率最低。1.3西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫和转移贝蛔虫mtDNAs的22个tRNA及2个rRNA基因与多数蛔目线虫的长度相似,而它们的AT富含区却是目前所蛔目线虫中长度最长的,长度分别为1406bp、1282bp、1516bp。在二级结构上,tRNA、rRNA以及非编码区(包括AT富含区和NCR区)的预测二级结构与猪蛔虫等蛔目线虫的基本类似。1.4基于线粒体基因组的系统进化分析(NJ、MP、ML)表明小熊猫贝蛔虫隶属于蛔目蛔科贝蛔属,且在贝蛔属内与转移贝蛔虫亲缘关系最近。另外,与三种弓首属蛔虫(犬弓蛔虫、猫弓蛔虫和马来西亚弓蛔虫)(弓首科)和单一异尖线虫(异尖科)相比,三种贝蛔虫与猪蛔虫(蛔科)的亲缘关系较近；该结果与之前的形态学及分子生物学研究结果一致。2.浣熊贝蛔虫线粒体全基因组研究2.1浣熊贝蛔虫线粒体全基因组全长14781bp,内含12个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因。36个基因均位于该基因组的同一条链上且按一致方向转录(即5’-3’),与多数线虫类似(除旋毛虫和美洲剑线虫外),其排列顺序与蛔目、圆形目线虫以及秀丽隐杆线虫的完全一致。整个线粒体基因中组碱基总的AT含量为70.5%,其中蛋白质编码基因占68.6%、rRNAs占72.0%、tRNAs占69.6%、AT富集区占82.8%。2.2浣熊贝蛔虫;ntDNA包含17个基因间隔区(包括NCR在内),长度介于1-118bp,占了整个基因组长度的1.42%,是目前所报道线虫线粒体:ntDNA中基因间隔数量最多的基因组。此外,整个基因组还存在两个基因重叠区域,一个位于coxl基因与trnC基因之间,重叠长度为1bp；一个位于trnF基因与cytb基因之间,重叠长度为3bp。2.3浣熊贝蛔虫线粒体基因组编码链的AT-skew和GC-skew分别为-0.376和0.448,与其它已知线虫mtDNAs的AT-skew值和GC-skew值相比,该值偏大,表明浣熊贝蛔虫mtDNA有明显的TG偏向。12个蛋白质编码基因中,四种碱基的使用频率为T>G>A>C,其中碱基T的使用率为50.8%,而碱基C的使用率仅为8.31%。2.4浣熊贝蛔虫mtDNA的12个蛋白质编码基因中,6个基因(cox1-2、nadl、 nad3-4和nad6)选择TTG作为翻译的起始密码子、3个基因(nad2、cytb和cox3)选择GTG作为翻译的起始密码子,而nad4L与nad5基因以及atp6基因分别选择ATT和ATA作为的其翻译起始密码；在终止密码子选择上,8个基因(atp6、cytb、cox1-3、nadl、nad4和nad6)选择以TAG作为其翻译的终止密码子,仅nad3和nad4L基因选择TAA作为其翻译的终止密码子,而nad2和nad5基因则以不完整终止密码子T作其翻译的终止密码子。2.5浣熊贝蛔虫mtDNA中,22个tRNAs的长度介于51-62bp之间。它们的位置及其反密码子与西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫、转移贝蛔虫、犬弓蛔虫、猫弓蛔虫和马来西亚弓蛔虫的完全一致。22个tRNA中,20个tRNA拥有DHU环和TV取代环,2个tRNA (tRNA-Ser (AGN)和tRNA-Ser (UCN))拥有TΨC环,但缺乏DHU环,与多数尾感器亚纲线虫(如蛔目线虫)的tRNAs结构类似。2个rRNAs基因(rrnS和rrnL)在长度和二级结构上均都与西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫、转移贝蛔虫的相似,推测可能与其结构和功能的保守性相关。2.6浣熊贝蛔虫mtDNA的AT富含区,长度为1375bp,与同属的西氏贝蛔虫(1406bp)、小熊猫贝蛔虫(1282bp)、转移贝蛔虫(1516bp)相比,属于蛔目线虫中AT富含区最长的一类。其AT富含区内包含31个数量不等的TA重复区(3-21个),总长度为344bp,与多数尾感器亚纲线虫的类似,但其不含有如秀丽隐杆线虫的(CR1-CR6)的等结构。2.7基于氨基酸水平和核苷酸水平的相似性比较与sliding window分析表明整个蛔目线虫线粒体基因组中coxl和cox2是最保守蛋白质编码基因,而cytb和nad4则是最可变蛋白质编码基因。基于此,rrnL和cytb基因被选为蛔目线虫新的PCR物种鉴定分子标记。随即2对浣熊贝蛔虫特异性扩增引物A、B被设计,其引物序列以及扩增长度分别为：A (rrnL) forward5’-GAGAACTGGCGGGG-3’, reverse5’-CTCACACTGACTTACACACC-3’(200bp); B (cytb) forward5’-TCCTTAGTAATGAGTATTGCGT-3’, reverse5’-TATAACGACATTTGAAA-AACACC-3’(548bp)。2.8基于蛔目11种线虫线粒体12个蛋白质编码基因的氨基酸序列构建的系统树(NJ、 MP、ML)表明在贝蛔属内浣熊贝蛔虫与西氏贝蛔虫的亲缘关系最近,而在整个蛔目线虫内贝蛔属种类则与蛔属物种的亲缘关系较弓首属、异尖属和对忙囊属物种近,该结果与之前的形态学及分子生物学研究结果一致。西氏贝蛔虫、小熊猫贝蛔虫、转移贝蛔虫及浣熊贝蛔虫的线粒体基因组代表了贝蛔属首批被完整测序的线粒体基因,它们的最终测定不仅丰富了蛔目线虫这一有着重要社会和经济意义群体的mtDNA资源库；而且为我们进行野生动物重要寄生性线虫的系统进化、种群遗传结构、流行病学以及生态学研究提供了宝贵的生物信息学资源,并为我们进一步预防和控制该类寄生虫病奠定了基础。