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红松子（Pinus Koraiensis）蛋白及其水解物具有多种功能活性，同时也具备良好的理化性质和加工性能。在食品加工中最常见的热处理会破坏蛋白质结构，导致蛋白质变性，最终使蛋白质聚集。多数食物蛋白质的结构尚未解析，无法从蛋白质结构的角度揭示蛋白质聚集的形成机制，对蛋白质聚集的调控造成了困难。因此，如何从蛋白质结构角度分析食源性蛋白质热变性的聚集机制及调控蛋白质聚集形成，优化蛋白质加工工艺是现代食品加工业亟待解决的关键科学问题。本文以红松子蛋白为研究对象，采用电子束辐照技术辅助提取红松子粗蛋白，优化红松子粗蛋白的提取工艺，并对辐照技术改性的红松子粗蛋白进行表观形貌及结构表征。同时，通过对红松转录组进行数据筛选，获得高表达的红松子蛋白基因序列，采用深度学习算法对红松子蛋白质组进行结构预测、功能预测及聚集性预测，获得红松子蛋白聚集倾向区域，明确蛋白质结构与其聚集特性的关系。此外，以模式蛋白牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)与红松子vicilin蛋白(Korean pine(Pinus koraiensis)vicilin）对照，对BSA及红松子vicilin蛋白分别通过糖化结构修饰和改变溶液体系离子环境以调节蛋白质聚集的形成，系统分析红松子vicilin蛋白在热处理下聚集的形成及调控机制，为食源性蛋白质的加工及综合利用提供新思路。本文的主要研究内容和结论如下：
(1)以榨油处理后的红松子粕为原料，以蛋白质提取率为指标，采用碱溶酸沉法结合响应面实验设计，优化红松子粗蛋白提取最优工艺，并构建了回归模型：Y=68.652+4.5861X1-0.0241X2-0.2347X3+2.4768XIX2+2.4453XIX3-4.1578X2X3-1.2526Xi2—7.6017X22—6.3175X32。式中，Y为蛋白质提取率，Xl，X2，X3分别为料液比(mL/g)，pH和提取时间(min)。获得红松子粗蛋白提取最优工艺为：料液比1:9，pH10.1，提取时间31min。采用电子束辐照技术辅助处理红松子粕，对于其主要营养成分无显著性影响。此外，采用响应面实验获得的最优工艺对电子束辐照后的红松子粕进行粗蛋白提取，粗蛋白提取率由69.50±1.15%显著增加到79.27±0.14%。此外，对电子束辐照技术辅助提高红松子粗蛋白提取率的机理进行探究，结果表明，在高能电子束的轰击下，蛋白质表面结构被破坏而穿孔，形成“蜂窝”结构，蛋白质平均粒度减小，ζ-电位增加，内部巯基暴露，使得粗蛋白结构变得松散、不稳定，利于蛋白质在碱液中溶解，促使粗蛋白提取率的提高。
(2)对红松转录组进行差异性表达数据筛选，获得在红松子中特异性高表达的2136个氨基酸序列，以其为数据集采用蛋白质结构预测算法C-I-TASSER获得2136个红松子蛋白预测模型，同时采用基于结构的功能预测算法MetaGO对2136个红松子蛋白进行GO功能预测。结果表明，结构信息对GO功能预测的特异性和准确度有重要贡献。同时，对预测红松子蛋白comp41271_c0与模型蛋白3KSC和红松子vicilin蛋白(PDB ID:4LEJ)的GO功能进行比较分析，发现预测红松子蛋白comp41271_c0具有贮存营养活性和金属离子结合活性，这与3KSC和4LEJ的GO功能完全吻合。采用基于结构的蛋白质聚集预测算法Aggrescan3D对预测结构置信度(C-score)最高的红松子蛋白comp17425_c0、红松子vicilin蛋白、模式蛋白BSA(PDB ID:3V03)进行聚集性打分，分别为-0.3577、-0.4378和-0.4739。由此，目标蛋白的聚集性强弱依次为comp17425_c0＞4LEJ＞3V03。同时获得聚集倾向残基区域，BSA的结构稳定性最强，聚集倾向残基区域为L189、V228、L282、V497、V551、V569、V576，红松子vicilin蛋白的聚集倾向区域为I76、V140、F209、V213、I228、L341、I358、L425、F427、V438，红松子预测模型蛋白comp17425_c0的聚集倾向残基区域为I2、F3、L10、L16、L23、I27、L46、I59、F106、V180、L208、Y214、F215。
(3)基于美拉德反应采用D-木糖诱导BSA和红松子vicilin蛋白发生糖化结构修饰，对其聚集形成进行调控，并采用HPLC-ESI-MS/MS确定糖化位点。结果表明，糖化对蛋白质聚集动力学的影响是一个非线性过程，与糖／蛋白比率有关。低浓度D-木糖条件下，糖化作用可稳定BSA和红松子vicilin蛋白的二级和三级构象。然而，对于高浓度的D-木糖，糖化作用会促进α-螺旋结构向无规则卷曲和β-折叠结构的转化，并诱导短淀粉样纤维化聚集体的形成。此外，在低浓度D-木糖诱导下，BSA和红松子vicilin蛋白均有3个糖化位点，分别为K12、K322、K396和R21、K210、K218，而在高浓度D-木糖条件下，BSA和红松子vicilin蛋白均检测出额外3个糖化位点，分别为K280、K316、R444和R30、R227、R306。对于低糖／蛋白比率的糖化作用，蛋白的糖化修饰可能会增加溶解度和位阻，从而减少热处理过程中的聚集。对于高糖／蛋白比率的糖化作用，糖化程度和糖化位点的提高可能会显著改变蛋白质构象及其表面性质，包括静电相互作用和亲水相互作用，加速加热过程中蛋白的展开和变性，从而导致短淀粉样纤维化聚集体的形成。
(4)改变溶液体系的离子强度可以调控蛋白质聚集的形成，采用Mg2+对BSA和红松子vicilin蛋白的稳定性保护作用进行分析。结果表明，Mg2+对BSA体系的平均粒径分布、二级结构、一级结构均有显著的保护效果，而Mg2+对于热诱导下红松子vicilin蛋白聚集作用并不显著，但对可以保护α-螺旋向β-折叠的转化，对二级结构稳定化起到重要作用。同时，采用分子动力学模拟进一步分析了Mg2+-3V03和Mg2+-4LEJ的可能的结合位点和蛋白构象变化，对于Mg2+-3V03体系，三次平行模拟实验获得16个稳定的Mg2+结合位点，其中Mg2+与每个中的至少两个Asp或Glu残基多价键合，形成Asp-Mg2+-Asp、Asp-Mg2+-Glu、Glu-Mg2+-Glu的类“二硫键”结构，交联两个相邻氨基酸以保证蛋白结构稳定。而对于Mg2+-4LEJ体系，Mg2+与红松子vicilin蛋白的相互作用并不稳定，仅在一次模拟中得到Mg2+-Glu(434)／Glu(437)的类“二硫键”结构。BSA与红松子vicilin蛋白的结构稳定性与Aggrescan3D的聚集性预测结果吻合。
(1)以榨油处理后的红松子粕为原料，以蛋白质提取率为指标，采用碱溶酸沉法结合响应面实验设计，优化红松子粗蛋白提取最优工艺，并构建了回归模型：Y=68.652+4.5861X1-0.0241X2-0.2347X3+2.4768XIX2+2.4453XIX3-4.1578X2X3-1.2526Xi2—7.6017X22—6.3175X32。式中，Y为蛋白质提取率，Xl，X2，X3分别为料液比(mL/g)，pH和提取时间(min)。获得红松子粗蛋白提取最优工艺为：料液比1:9，pH10.1，提取时间31min。采用电子束辐照技术辅助处理红松子粕，对于其主要营养成分无显著性影响。此外，采用响应面实验获得的最优工艺对电子束辐照后的红松子粕进行粗蛋白提取，粗蛋白提取率由69.50±1.15%显著增加到79.27±0.14%。此外，对电子束辐照技术辅助提高红松子粗蛋白提取率的机理进行探究，结果表明，在高能电子束的轰击下，蛋白质表面结构被破坏而穿孔，形成“蜂窝”结构，蛋白质平均粒度减小，ζ-电位增加，内部巯基暴露，使得粗蛋白结构变得松散、不稳定，利于蛋白质在碱液中溶解，促使粗蛋白提取率的提高。
(2)对红松转录组进行差异性表达数据筛选，获得在红松子中特异性高表达的2136个氨基酸序列，以其为数据集采用蛋白质结构预测算法C-I-TASSER获得2136个红松子蛋白预测模型，同时采用基于结构的功能预测算法MetaGO对2136个红松子蛋白进行GO功能预测。结果表明，结构信息对GO功能预测的特异性和准确度有重要贡献。同时，对预测红松子蛋白comp41271_c0与模型蛋白3KSC和红松子vicilin蛋白(PDB ID:4LEJ)的GO功能进行比较分析，发现预测红松子蛋白comp41271_c0具有贮存营养活性和金属离子结合活性，这与3KSC和4LEJ的GO功能完全吻合。采用基于结构的蛋白质聚集预测算法Aggrescan3D对预测结构置信度(C-score)最高的红松子蛋白comp17425_c0、红松子vicilin蛋白、模式蛋白BSA(PDB ID:3V03)进行聚集性打分，分别为-0.3577、-0.4378和-0.4739。由此，目标蛋白的聚集性强弱依次为comp17425_c0＞4LEJ＞3V03。同时获得聚集倾向残基区域，BSA的结构稳定性最强，聚集倾向残基区域为L189、V228、L282、V497、V551、V569、V576，红松子vicilin蛋白的聚集倾向区域为I76、V140、F209、V213、I228、L341、I358、L425、F427、V438，红松子预测模型蛋白comp17425_c0的聚集倾向残基区域为I2、F3、L10、L16、L23、I27、L46、I59、F106、V180、L208、Y214、F215。
(3)基于美拉德反应采用D-木糖诱导BSA和红松子vicilin蛋白发生糖化结构修饰，对其聚集形成进行调控，并采用HPLC-ESI-MS/MS确定糖化位点。结果表明，糖化对蛋白质聚集动力学的影响是一个非线性过程，与糖／蛋白比率有关。低浓度D-木糖条件下，糖化作用可稳定BSA和红松子vicilin蛋白的二级和三级构象。然而，对于高浓度的D-木糖，糖化作用会促进α-螺旋结构向无规则卷曲和β-折叠结构的转化，并诱导短淀粉样纤维化聚集体的形成。此外，在低浓度D-木糖诱导下，BSA和红松子vicilin蛋白均有3个糖化位点，分别为K12、K322、K396和R21、K210、K218，而在高浓度D-木糖条件下，BSA和红松子vicilin蛋白均检测出额外3个糖化位点，分别为K280、K316、R444和R30、R227、R306。对于低糖／蛋白比率的糖化作用，蛋白的糖化修饰可能会增加溶解度和位阻，从而减少热处理过程中的聚集。对于高糖／蛋白比率的糖化作用，糖化程度和糖化位点的提高可能会显著改变蛋白质构象及其表面性质，包括静电相互作用和亲水相互作用，加速加热过程中蛋白的展开和变性，从而导致短淀粉样纤维化聚集体的形成。
(4)改变溶液体系的离子强度可以调控蛋白质聚集的形成，采用Mg2+对BSA和红松子vicilin蛋白的稳定性保护作用进行分析。结果表明，Mg2+对BSA体系的平均粒径分布、二级结构、一级结构均有显著的保护效果，而Mg2+对于热诱导下红松子vicilin蛋白聚集作用并不显著，但对可以保护α-螺旋向β-折叠的转化，对二级结构稳定化起到重要作用。同时，采用分子动力学模拟进一步分析了Mg2+-3V03和Mg2+-4LEJ的可能的结合位点和蛋白构象变化，对于Mg2+-3V03体系，三次平行模拟实验获得16个稳定的Mg2+结合位点，其中Mg2+与每个中的至少两个Asp或Glu残基多价键合，形成Asp-Mg2+-Asp、Asp-Mg2+-Glu、Glu-Mg2+-Glu的类“二硫键”结构，交联两个相邻氨基酸以保证蛋白结构稳定。而对于Mg2+-4LEJ体系，Mg2+与红松子vicilin蛋白的相互作用并不稳定，仅在一次模拟中得到Mg2+-Glu(434)／Glu(437)的类“二硫键”结构。BSA与红松子vicilin蛋白的结构稳定性与Aggrescan3D的聚集性预测结果吻合。