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目的:心血管疾病和肿瘤是人类死亡的两个重要原因。阿霉素（Doxorubicin,DOX）是目前最常用的广谱蒽环类抗肿瘤药物之一,广泛应用在白血病、乳腺癌、卵巢癌、肝癌和肺癌等患者的治疗中。然而,一部分肿瘤患者长期使用DOX后可出现明显的心肌损伤,导致心脏结构和功能改变,进而出现心肌病或充血性心力衰竭,因此,DOX所致的心肌损伤限制了其在肿瘤患者中的应用。目前临床上对DOX心肌损伤缺乏有效的防治手段,因此,阐明DOX心肌损伤的机制并找到干预靶点,将为临床上DOX心肌损伤的防治奠定基础。铁死亡是一种新的细胞死亡形式,是铁依赖的细胞内脂质过氧化产物和活性氧积累为主要特征的非细胞凋亡的死亡形式。铁死亡的形态学特征表现为线粒体变小,线粒体膜密度浓缩,线粒体嵴减少或消失,线粒体外膜破裂。研究认为,铁死亡参与多种病理过程,包括癌症,神经退行性病变,急性肝肾损伤等。近年的研究发现,铁死亡在DOX心肌损伤和心肌缺血再灌注损伤等心血管疾病中发挥重要作用。E1A激活基因阻遏子基因（cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG）是1998年哈佛大学医学院Gill教授在Hela细胞中发现的一个基因。CREG是一个含220个氨基酸、3个M6P糖基化位点的分泌型糖蛋白。CREG主要定位于溶酶体及核周内质网,并且在成体的组织和细胞中广泛表达,在组织和细胞的分化稳态调控中发挥重要作用。既往研究表明,CREG是一种重要的心肌保护因子,在维持心肌细胞分化及稳态调控中发挥重要作用。研究发现,在主动脉缩窄（transverse aortic constriction,TAC）模型中,CREG蛋白表达明显下降,过表达CREG降低心肌纤维化情况。然而,CREG在DOX心肌损伤中的作用及机制目前未见相关报道。根据上述结果,我们提出假设,CREG作为调控铁死亡的内源性关键调控基因,在DOX心肌损伤发生和发展中起保护作用。因此,本研究选用CREG转基因小鼠和心肌特异性敲除小鼠建立DOX心肌损伤模型,同时在细胞学水平建立DOX心肌损伤细胞学模型,从在体和离体水平明确CREG对DOX心肌损伤后铁死亡的影响,并初步阐述了其分子机制。研究方法:1.CREG表达变化与阿霉素心肌损伤的相关性研究（1）利用腹腔注射DOX的方法建立小鼠DOX心肌损伤模型,对照组腹腔注射同等剂量的PBS。通过检测小鼠心脏收缩及舒张功能、体重、心重、心脏组织苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色、Sirius染色和麦胚凝集素（wheat germ agglutinin,WGA）染色来评价DOX心肌损伤建模是否成功。（2）通过Elisa检测各组小鼠血清心肌损伤标志物肌酸激酶同工酶（creatine Kinase Isoenzyme,CKMB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）、谷草转氨酶（glutamic oxalacetic transaminase,AST）表达情况。利用定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法检测各组小鼠心衰标志物B型利钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）的表达情况。（3）利用定量PCR、western blot及免疫组织化学染色方法检测DOX组及对照组小鼠心脏组织中CREG基因m RNA和蛋白表达。（4）建立DOX心肌细胞损伤模型,提取新生小鼠原代心肌细胞（neonatal mouse cardiomyocytes,NMCMs）,DOX（10μM）刺激24h建立DOX心肌损伤细胞模型,利用PCR、western blot和免疫荧光染色方法检测CREG基因m RNA和蛋白表达。2.CREG在阿霉素心肌损伤中的作用研究（1）利用CREG转基因小鼠（TG-CREG）及其同窝对照小鼠（ctrl）建立DOX心肌损伤模型,通过测量小鼠体重,心重,计算小鼠心重/体重比来比较各组小鼠心脏大小。通过心脏超声、心脏组织HE染色、Sirius染色和WGA染色来评价CREG过表达后对DOX心肌损伤后心脏功能及心脏形态学的影响。之后取各组小鼠血清,通过Elisa检测各组小鼠血清心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST表达情况。利用PCR方法检测各组小鼠心衰标志物BNP的表达情况。最后取心脏组织,利用定量PCR和western blot方法检测各组小鼠心脏组织中CREG的转录水平和蛋白水平表达。（2）利用心肌特异性CREG敲除小鼠（CREG-CKO）及其同窝对照小鼠CREGfl/fl（ctrl）建立DOX心肌损伤模型,通过测量小鼠体重,心重,计算小鼠心重/体重比比较各组小鼠心脏大小。通过心脏超声、心脏组织HE染色、Sirius染色和WGA染色来评价CREG低表达后对DOX心肌损伤后心脏功能及心脏形态学的影响。之后取各组小鼠血清,通过Elisa检测各组小鼠血清心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST的表达情况。利用PCR方法检测各组小鼠心衰标志物BNP的表达情况。最后取心脏组织,利用定量PCR和western blot方法检测各组小鼠心脏组织中CREG的转录水平和蛋白水平表达。3.CREG在阿霉素心肌损伤中的机制研究（1）利用Elisa方法检测TG-CREG组与ctrl组小鼠建模后血清中铁离子、丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平。取各组小鼠新鲜心室组织,电镜检测异常线粒体情况。定量PCR检测各组小鼠组织中CREG、铁死亡相关蛋白包括核相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2,NRF2）、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1,HO-1）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2,ptgs2）、环氧合酶-4（cytochrome C oxidase subunit 4,COX4）的表达。利用免疫组织化学染色方法检测DOX组小鼠心肌组织中CREG、ptgs2的表达。Western blot检测TG-CREG组与ctrl组小鼠建模后心脏组织中CREG蛋白、铁死亡相关蛋白NRF2、HO-1、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）、ptgs2、COX4的表达。（2）利用elisa方法检测CREG-CKO组与ctrl组建模后血清中铁离子、MDA水平。取各组小鼠新鲜心室组织,电镜检测异常线粒体情况。定量PCR检测各组小鼠组织中CREG、铁死亡相关蛋白,包括NRF2、HO-1、ptgs2、COX4的表达。使用免疫组织化学染色方法检测DOX组小鼠心肌组织中CREG、ptgs2的表达。使用western blot方法检测CREG-CKO组与ctrl组小鼠建模后心脏组织中CREG蛋白、铁死亡相关蛋白NRF2、HO-1、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）、ptgs2、COX4的表达。（3）在NMCMs中,通过感染腺病毒建立CREG过表达（Ad-CREG）模型后予DOX刺激,建立DOX心肌损伤的细胞模型,western blot检测CREG、铁死亡相关指标NRF2、HO-1、4-HNE、ptgs2、COX4的蛋白水平变化。利用定量PCR方法检测CREG及铁死亡相关指标NRF2、HO-1、ptgs2、COX4在m RNA水平的表达。通过ROS荧光探针-二氢乙啶（dihydroetidium,DHE）染色来检测NMCMs各组细胞氧化应激的改变,通过线粒体膜电位染色（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide,JC-1）来检测NMCMs各组细胞线粒体功能的改变。（4）在NMCMs中,通过转染小干扰RNA的方法建立CREG低表达（Si-CREG）模型后给予DOX刺激,建立DOX心肌损伤的细胞模型,利用Western blot方法检测CREG及铁死亡相关指标NRF2、HO-1、4-HNE、ptgs2、COX4的变化。利用定量PCR方法检测CREG、NRF2、HO-1、ptgs2、COX4在m RNA水平的表达。通过DHE染色检测NMCMs各组细胞氧化应激的改变,通过JC-1染色检测NMCMs各组细胞线粒体功能的改变。（5）确定CREG与NRF2的上下游关系。通过感染腺病毒以及RNA干扰的方法分别建立NRF2过表达（Ad-NRF2）、NRF2低表达（Si-NRF2）模型,并给予DOX刺激,利用western blot检测CREG及铁死亡相关蛋白NRF2、HO-1、4-HNE、ptgs2、COX4的变化,确定CREG与NRF2的上下游关系。（6）明确过表达NRF2是否能改善CREG降低所造成的心肌细胞铁死亡。在敲减CREG的同时将NRF2过表达,再给予DOX刺激,利用western blot检测CREG及铁死亡相关蛋白NRF2、HO-1、4-HNE、ptgs2的变化。通过DHE染色检测氧化应激情况,通过JC-1染色评价细胞线粒体功能。结果:1.CREG在阿霉素心肌损伤后转录水平和蛋白水平显著降低（1）与对照组相比,DOX组小鼠心脏收缩及舒张功能明显降低;体重降低、心脏缩小,心肌细胞面积减小。（2）与对照组相比,DOX组小鼠,心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST和BNP均明显升高。（3）定量PCR结果显示,与对照组相比,DOX组小鼠心脏组织中CREG基因转录水平明显降低;Western blot和免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,DOX组小鼠心脏组织中CREG蛋白明显降低。（4）在DOX心肌损伤的细胞模型中发现,与对照组相比,CREG转录水平、蛋白水平在DOX组明显降低。综上所述,成功建立DOX心肌损伤的动物模型和细胞模型。DOX心肌损伤后,CREG基因转录水平和蛋白水平均显著降低。2.CREG在阿霉素心肌损伤中起保护作用。（1）与TG-CREG组及ctrl组相比,TG-CREG+DOX组与DOX组小鼠心脏收缩及舒张功能、体重、心重降低;与ctr组相比,DOX组小鼠心肌细胞面积明显缩小;TG-CREG+DOX组小鼠较DOX组相比小鼠心脏收缩及舒张功能、体重、心重有所升高,心肌细胞面积明显增大。与TG-CREG组及ctrl组相比,TG-CREG+DOX组与DOX组小鼠心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST、BNP均明显升高;相比于DOX组,TG-CREG+DOX组小鼠心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST、BNP有所降低。定量PCR及Western blot结果显示,TG-CREG组小鼠心脏组织中CREG表达较ctrl组小鼠明显升高;与TG-CREG组及ctrl组相比,TG-CREG+DOX组与DOX组小鼠心脏组织中CREG在m RNA水平、蛋白水平均明显降低;TG-CREG+DOX组小鼠心脏组织中CREG在m RNA水平、蛋白水平较DOX组有所升高。（2）与CREG-CKO组及ctrl组相比,CREG-CKO+DOX组与DOX组小鼠心脏收缩及舒张功能、体重、心重降低,心肌细胞面积减小;CREG-CKO+DOX组小鼠较DOX组小鼠心脏收缩及舒张功能、体重、心重降低更为明显,心肌细胞面积进一步缩小。与CREG-CKO组及ctrl组相比,CREG-CKO+DOX组与DOX组小鼠心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST、BNP均升高;CREG-CKO+DOX组小鼠较DOX组小鼠心肌损伤标志物CKMB、LDH、AST、BNP进一步升高,心肌损伤进一步加重。定量PCR及Western blot结果显示,CREG-CKO组小鼠心脏组织中CREG表达较ctrl组小鼠明显降低;与CREG-CKO组及ctrl组相比,CREG-CKO+DOX组与DOX组小鼠心脏组织中CREG在m RNA水平、蛋白水平均明显降低;CREG-CKO+DOX组小鼠心脏组织中CREG在m RNA水平、蛋白水平较DOX组进一步降低。3.CREG通过调控NRF2蛋白表达影响阿霉素心肌损伤后心肌细胞的铁死亡。（1）与TG-CREG组及ctrl组相比,TG-CREG+DOX组与DOX组小鼠心脏组织均出现明显的铁死亡,主要表现为血清铁离子水平、MDA水平明显升高;TG-CREG+DOX组小鼠较DOX组小鼠血清铁离子水平、血清MDA水平有所降低。与TG-CREG组及ctrl组相比,TG-CREG+DOX组与DOX组小鼠心脏组织线粒体受损明显加重;TG-CREG+DOX组小鼠较DOX组小鼠心脏组织线粒体受损明显缓解。与TG-CREG组及ctrl组相比,TG-CREG+DOX组与DOX组小鼠心脏组织铁死亡预测标志物ptgs2和氧化应激指标4-HNE表达增加,铁死亡通路蛋白NRF2、HO-1和COX4表达降低;TG-CREG+DOX组小鼠较DOX组小鼠ptgs2和4-HNE表达有所降低,NRF2、HO-1和COX4表达有所升高。（2）与CREG-CKO组及ctrl组相比,CREG-CKO+DOX组与DOX组小鼠心脏组织均出现明显的铁死亡,主要表现为血清铁离子水平、MDA水平明显升高;CREG-CKO+DOX组小鼠相比DOX组小鼠血清铁离子水平、血清MDA水平进一步升高。与CREG-CKO组及ctrl组相比,CREG-CKO+DOX组与DOX组小鼠心脏组织线粒体受损明显加重;CREG-CKO+DOX组小鼠相比DOX组小鼠心脏组织线粒体受损进一步加重。与CREG-CKO组及ctrl组相比,CREG-CKO+DOX组与DOX组小鼠心脏组织铁死亡预测标志物ptgs2和氧化应激指标4-HNE表达增加,铁死亡通路蛋白NRF2、HO-1和COX4表达降低;CREG-CKO+DOX组小鼠相比DOX组小鼠ptgs2和4-HNE表达升高,NRF2、HO-1和COX4表达降低。（3）Ad-CREG组和Ad-ctrl组经DOX刺激后,均出现铁死亡,主要表现为铁死亡预测标志物ptgs2和氧化应激指标4-HNE表达增加;Ad-ctrl组经DOX刺激后铁死亡通路蛋白NRF2、HO-1和COX4表达降低;与Ad-ctrl+DOX相比,Ad-CREG+DOX组ptgs2和4-HNE表达降低,NRF2、HO-1和COX4表达升高。与对照组相比,Ad-CREG组和Ad-ctrl组经DOX刺激后,均出现氧化应激标志ROS染色明显增强;与Ad-ctrl+DOX组相比,Ad-CREG+DOX组氧化标志ROS染色明显减弱。与对照组相比,Ad-CREG组和Ad-ctrl组经DOX刺激后,均出现线粒体膜电位检测指标JC-1染色异常,JC-1 monomeric明显增多,JC-1 aggregate明显减少;与Ad-ctrl+DOX组相比,Ad-CREG+DOX组线粒体膜电位检测指标JC-1 monomeric明显减少,JC-1 aggregate明显增多。（4）与对照组相比,Si-CREG组和Si-ctrl组经DOX刺激后,均出现铁死亡,主要表现为铁死亡预测标志物ptgs2和氧化应激指标4-HNE表达增加,铁死亡通路蛋白NRF2、HO-1和COX4表达降低;与Si-ctrl+DOX组相比,Si-CREG+DOX组ptgs2和4-HNE表达进一步升高,NRF2、HO-1和COX4表达进一步降低。与对照组相比,Si-CREG组和Si-ctrl组经DOX刺激后,均出现氧化标志ROS染色明显增强;与Si-ctrl+DOX组相比,Si-CREG+DOX组氧化标志ROS染色明显增强。与对照组相比,Si-CREG组和Si-ctrl组经DOX刺激后,均出现线粒体膜电位检测指标JC-1染色异常,JC-1 monomeric明显增多,JC-1 aggregate明显减少;与Si-ctrl+DOX组相比,Si-CREG+DOX组线粒体膜电位检测指标JC-1 monomeric明显增加,JC-1 aggregate明显减少。（5）与Ad-ctrl组相比,Ad-NRF2组CREG蛋白水平无明显变化;与Si-ctrl组相比,Si-NRF2组CREG蛋白水平无明显变化。（6）与Si-CREG组相比,Si-CREG+Ad-NRF2组中NRF2蛋白表达升高,CREG蛋白表达无明显改变;与Si-CREG+DOX组相比,Si-CREG+Ad-NRF2+DOX组中CREG蛋白表达无明显变化,NRF2和HO-1的蛋白表达明显升高,4-HNE、ptgs2的蛋白表达明显下降。与Si-CREG组相比,Si-CREG+Ad-NRF2组中ROS的荧光强度明显减弱;与Si-CREG+DOX组相比,Si-CREG+Ad-NRF2+DOX组中ROS的荧光强度明显减弱。与Si-CREG组相比,Si-CREG+Ad-NRF2组中JC-1多聚体数量有所回升,JC-1单倍体数量明显下降,提示线粒体功能有所恢复;与Si-CREG+DOX组相比,Si-CREG+Ad-NRF2+DOX组中JC-1多聚体数量明显回升,单倍体数量明显下降。结论:1.在阿霉素心肌损伤后,CREG基因转录水平表达和蛋白水平表达明显下降。2.CREG对阿霉素心肌损伤起保护作用。在发生阿霉素心肌损伤时,CREG转基因小鼠可明显减轻心肌损伤,而心肌特异性CREG敲除小鼠可显著加重心肌损伤。3.CREG作为NRF2的上游分子,通过调控NRF2表达抑制了阿霉素心肌损伤心肌细胞的铁死亡,进而抑制阿霉素心肌损伤的发生发展。