猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响世界养猪业的重要病原之一,造成巨大经济损失。PRRSV可通过多种途径宿主逃避免疫应答,包括调节IL-10、抑制巨噬细胞和树突状细胞功能和抑制Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)产生等,从而导致病毒持续感染,但其分子机制尚不十分清楚。为了探究PRRSV编码蛋白对TLR3和IL-10表达影响,本研究构建了PRRSV部分非结构蛋白的真核表达质粒,证明Nsp1和Nsp11可以抑制TLR3启动子活性,初步探索了其可能机制；同时还构建了PRRSV结构蛋白真核表达质粒,证明GP5和N蛋白可以诱生IL-10表达；另外,还构建了Nsp4,Nsp7,Nsp12的真核表达质粒,观察了其作为基因疫苗的免疫特性。具体研究内如下：1.PRRSV 3个非结构蛋白对TLR3启动子活性的影响及其机理PRRSV ORF1a和ORF1b可以翻译形成14个病毒非结构蛋白,其中部分非结构蛋白具有抑制I型干扰素活性的功能。TLR3是先天性免疫中重要的受体分子,它经dsRNA刺激后可以诱导产生干扰素和促炎症因子,启动先天性免疫反应。为了探究PRRSV非结构蛋白对TLR3转录表达的影响,本研究构建了PRRSV BB0907毒株Nsp1,Nsp1α、Nsp1α-△14、Nsp1β、Nsp7和Nsp11蛋白的真核表达质粒,利用双荧光素酶报告系统,检测了以上各蛋白对TLR3启动子活性的影响,发现Nsp1、Nsp1α和Nsp1β具有抑制TLR3启动子活性的能力,并且Nsp1α的C端锌指结构是其抑制活性所必须的。同时,Nsp11也具有抑制TLR3启动子活性的能力,并且呈剂量依赖关系；而且,Nsp11能够显著的抑制INF-β诱导下的TLR3启动子活性,表明Nsp11可能具有抑制JAK-STAT通路的活性。此结果在一定程度上解释了PRRSV易造成宿主先天性免疫低下原因,并为后续研究Nsp11的免疫抑制机理奠定了基础。2.PRRSV结构蛋白的真核表达及其对IL-10启动子活性的影响PRRSV可以通过诱导IL-10的产生来抑制免疫应答,造成持续性感染。为了探究PRRSV结构蛋白对IL-10的诱生能力,本研究首先构建了PRRSV BB0907毒株各结构蛋白的重组真核表达质粒,并在BHK-21细胞中利用间接免疫荧光的方法鉴定了其表达,再利用双荧光素酶报告系统,在PAM(3D4/2)细胞中检测其对IL-10启动子的激活能力。结果显示,GP5和N蛋白都能够显著性的激活IL-10的启动子,此为后续研究PRRSV诱生IL-10的具体机制奠定了基础。3.PRRSV Nsp4、Nsp7和Nsp12基因疫苗的构建及其免疫特性研究猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起猪的一种高度传染性疾病,为了有效控制该病,人们一直致力于通过筛选更有效的靶抗原来研制新型的PRRSV疫苗。然而现阶段,对靶抗原的筛选主要集中在PRRSV的结构蛋白上,对非结构蛋白的研究相对较少。为了探究PRRSV非结构蛋白作为免疫保护抗原的可行性,本研究选取了PRRSV BB090毒株Nsp4、Nsp7和Nsp12三种没有免疫抑制功能的非结构蛋白作为免疫靶蛋白,利用pcDNA3.1真核表达系统,并辅以GM-CSF基因作为免疫增强佐剂,KDEL序列作为目的蛋白定位序列,构建基因疫苗,并进行小鼠免疫试验,结果显示,真核表达的Nsp4、Nsp7和Nsp12能够引起一定的小鼠体液免疫应答,并且GM-CSF可以增强这种免疫应答,但是细胞免疫应答效果却不理想,为进一步对PRRSV疫苗候选抗原蛋白的筛选提供了一定理论基础。