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研究目的 肿瘤、炎症、外伤等多种原因均可造成颌骨组织缺损。干细胞在介导骨再生过程中起到了重要作用。然而,针对大块颌骨再生,一方面由于血管化问题,往往导致负载干细胞过早凋亡坏死;另一方面由于支架材料缺乏足够的成骨诱导能力,导致干细胞参与成骨受限,大大降低了骨再生效果。为此,本研究尝试通过生物材料管道设计、氧化石墨烯铜纳米颗粒(GO-Cu)涂层等手段来调控干细胞体内存活以及血管化骨再生,为促进大块颌骨再生的生物材料设计提供新的思路。材料与方法 1.分离培养犬骨髓干细胞(BMSCs)和脂肪干细胞(ADSCs);体外使用RT-PCT、免疫荧光等方法系统比较二者的成骨分化能力;GFP标记示踪观察裸鼠皮下异位成骨能力;进一步在犬上颌窦提升模型上,采用序贯荧光标记和硬组织切片等手段评估二者的快速骨再生效果。2.使用多孔/管道丝蛋白支架体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),检测HUVECs的生长、分泌活性及血管样结构预构情况;移植于裸鼠皮下后,采用Microfil血管灌注、激光多普勒血流检测、组织学分析等方法评估大块支架材料整体快速血管化效果。使用上述体外内皮化预构的多孔/管道丝蛋白支架负载小鼠BMSCs,移植于体内,使用活体荧光成像技术检测BMSCs体内存活情况。3.制备氧化石墨烯铜纳米颗粒(GO-Cu),涂层于硫酸钙骨水泥(CPC)多孔支架材料表面,ICP-AES电感耦合等离子体发射光谱仪检测铜离子缓释情况。Live/Dead细胞染色、MTT检测等方法评估GO-Cu对大鼠BMSCs的细胞毒性;免疫荧光染色、Western Blot(WB)、RT-PCR等方法检测GO-Cu调控大鼠BMSCs成骨向分化以及参与成血管诱导活性的作用机制;最后在大鼠颅骨缺损模型上评估GO-Cu涂层CPC支架材料(CPC/GO-Cu)的血管化骨再生效果。研究结果 1.BMSCs和ADSCs表面干细胞标志物表达水平相似,但BMSCs的体外成骨向分化能力明显优于ADSCs、分化速度更快,而ADSCs更易向成脂方向分化;经体外诱导后随支架材料埋植于裸鼠皮下四周时,BMSCs可以形成新骨,而ADSCs仅向成骨细胞分化、并未有骨组织形成;在犬上颌窦提升模型上,BMSCs较ADSCs同样表现出了更强、更快的骨再生能力。2.多孔/管道丝蛋白支架促进了HUVECs体外生长、成血管相关因子分泌以及血管样结构形成;将大块支架材料埋植于裸鼠皮下,管道结构促进了宿主组织细胞长入、加速了血管化进程;多孔/管道丝蛋白支架预植HUVECs后进一步促进了血管化进程;使用多孔/管道丝蛋白支架预植HUVECs构建的内皮化复合物来负载BMSCs,能够更好地维持移植干细胞的体内存活。3.GO-Cu在合适浓度范围内对BMSCs无明显细胞毒性,并且通过激活Erk1/2信号通路而促进BMSCs高表达Hif-1α,并刺激分泌BMP-2和VEGF成骨成血管蛋白因子;GO-Cu涂层于CPC支架材料后,可以长期缓慢释放铜离子,即能维持局部的铜离子浓度,又避免了爆发性、快速释放所造成的铜离子蓄积;将CPC/GO-Cu置于大鼠颅骨缺损区,明显促进了血管化骨再生。研究结论 本论文系统比较了ADSCs和BMSCs的成骨效果,优选了BMSCs作为颌面部骨组织快速再生的种子细胞。发现使用多孔/管道结构支架预植内皮细胞,可以促进大块支架材料整体快速血管化,进而促进负载的BMSCs细胞体内存活。还制备了氧化石墨烯铜纳米颗粒,GO-Cu涂层可以刺激BMSCs分泌成骨成血管生长因子,促进血管化骨再生。综上,本研究尝试了几种生物材料设计方案,能够有效地促进干细胞体内存活及血管化骨再生,可望为大块颌骨再生的材料设计提供新的思路。