【摘 要】
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目的:研究骨形态发生蛋白9（BMP9）对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发生发展的作用及机制。方法:1、经小鼠尾静脉注射过表达BMP9的腺相关病毒（AAV-BMP9）或空载对照病毒（AAV-null）,予以蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）或正常对照（CD）饮食4周,建立NASH模型。在饮食干预的前1天及干预后的第8、15、22天给予巨噬细胞清除试剂氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes,C
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目的:研究骨形态发生蛋白9（BMP9）对非酒精性脂肪性肝炎（NASH）发生发展的作用及机制。方法:1、经小鼠尾静脉注射过表达BMP9的腺相关病毒（AAV-BMP9）或空载对照病毒（AAV-null）,予以蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）或正常对照（CD）饮食4周,建立NASH模型。在饮食干预的前1天及干预后的第8、15、22天给予巨噬细胞清除试剂氯膦酸盐脂质体（clodronate liposomes,Clod.Lipo）或对照脂质体（control liposomes,CT.Lipo）。实验动物分为六组:空载病毒对照饮食组（AAV-null+CD+CT.Lipo）,过表达病毒对照饮食组（AAV-BMP9+CD+CT.Lipo）,空载病毒饮食干预组（AAV-null+MCD+CT.Lipo）,过表达病毒饮食干预组（AAV-BMP9+MCD+CT.Lipo）,空载病毒巨噬细胞清除组（AAV-null+MCD+Clod.Lipo）,过表达病毒巨噬细胞清除组（AAVBMP9+MCD+Clod.Lipo）。造模结束后,取实验动物血清和肝脏组织,检测血清ALT、AST和肝脏甘油三酯等生化指标,肝组织苏木素-伊红（HE）染色、油红O染色、天狼猩红染色来评估肝脏损伤程度。应用RT-PCR、Western Blot、免疫组化染色等分子生物学实验技术检测肝组织炎症及纤维化相关指标,应用Western Blot等分子生物学技术检测NF-κB信号通路相关蛋白的表达。2、体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,并构建Smad1沉默细胞系RAW-sh Smad1。用重组人BMP9蛋白（rh-BMP9,100 ng/ml）预处理RAW264.7细胞2 h后,给予脂多糖（LPS,100 ng/ml）继续干预24 h,应用RT-PCR检测细胞中BMP9信号通路及巨噬细胞M1型分化标志分子。用NF-κB抑制剂（BAY11-7085,5μM）预处理RAW264.7或RAW-sh Smad1细胞2 h后,给予rh-BMP9（100 ng/ml）继续干预16 h,应用RT-PCR、免疫荧光、Western Blot检测炎症相关指标及NF-κB信号通路相关蛋白的表达。结果:1.（1）MCD饮食诱导的NASH肝组织中BMP9的表达上调。（2）在CD饮食状态下,过表达BMP9对小鼠肝脏无明显影响;在MCD饮食诱导的NASH小鼠中,过表达BMP9可进一步增加由MCD饮食诱导升高的ALT、AST水平,增加肝脏M1型巨噬细胞数量（iNOS组化染色阳性细胞数）,加重肝脏脂肪变、炎症浸润程度和纤维化。（3）在MCD饮食诱导的NASH小鼠,过表达BMP9增加促炎因子F4/80、iNOS、CD86、IL6、IL1β、TNFα、MCP-1、COX2、IL12βm RNA水平及IL1β蛋白表达,增加促纤维化因子TGFβ1、COL-1的m RNA表达,促进NF-κB信号通路蛋白TLR4、p-IκBα、p-NFκB的表达,但在巨噬细胞清除后,BMP9促进肝损伤的效应被抑制,AAV-BMP9与AAV-null组间促炎因子和NF-κB信号通路蛋白表达无明显差异。2.（1）在体外RAW264.7细胞中,LPS干预细胞24 h后,BMP9及ALK1的m RNA水平增高,rh-BMP9增加了LPS介导的巨噬细胞M1型极化,进一步增强了CD86、iNOS、TNFα、MCP-1和COX2的表达水平。（2）在体外RAW264.7和RAW-sh Smad1细胞中,rh-BMP9增加炎症相关因子IL1β、TNFα、iNOS、MCP1、COX2的m RNA表达水平,并且使NF-κB核转位增加。但给予NF-κB抑制剂后,rh-BMP9促炎作用被抑制,NF-κB核转位减少。结论:1、在MCD饮食诱导的小鼠NASH模型中,过表达BMP9后肝脏炎症损伤加重,而巨噬细胞清除后,BMP9的促炎作用被抑制;2、BMP9可能通过NF-κB介导的肝脏巨噬细胞M1型极化促进NASH相关炎症;3、BMP9可能在NASH中起促进炎症的作用,为NASH的治疗提供潜在依据。
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