目的膀胱癌是人类常见恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的生命和健康。膀胱癌在我国泌尿系肿瘤中的发病率占第1位，复发率高是其显著特点，因此绝大多数患者在进行肿瘤切除手术后需进行膀胱灌注化疗。为了寻找一种更为有效的灌注化疗药物，国内外学者都在进行不懈的努力。羟基喜树碱（hydroxycamptothecin，HCPT）是从珙桐科植物喜树中提取得到的生物碱，从上世纪80年代开始应用于膀胱癌灌注化疗，并成为临床上进行膀胱癌化疗常用的药物之一，但其抗癌作用机制目前尚不十分清楚。近年研究发现，诱导细胞凋亡是HCPT发挥抗肿瘤作用的重要机制。Bcl-2基因是Bcl-2基因家族中最早被发现，也是最重要的抗凋亡基因。有研究发现，很多凋亡刺激因素诱导细胞凋亡过程中，伴有Bcl-2蛋白表达水平的下调。降低Bcl-2蛋白表达水平可能是凋亡刺激因素诱导细胞凋亡的重要机制。本研究应用HCPT作用于体外培养的人膀胱癌T24细胞，观察其作用效果，并检测药物作用后人膀胱癌T24细胞的Bcl-2蛋白的表达水平，探讨羟基喜树碱对人膀胱癌T24细胞的凋亡诱导作用及其机制，深入研究羟基喜树碱的生物学作用及其机制对膀胱癌的治疗具有重要的意义。方法一、MTT法检测细胞存活率对数生长期人膀胱癌T24细胞调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，接种于96孔培养板，24 h后加入终浓度分别为0.01、0.1、1、10μg/ml的羟基喜树碱，对照组加入等体积10％的1640培养液，每个浓度设6个平行孔。继续培养48 h，MTT法检测细胞存活率。二、TUNEL法人膀胱癌T24细胞接种于盖玻片上，设对照组和实验组，实验组采用1μg/ml羟基喜树碱处理48小时。从六孔板内取出盖玻片后，按照试剂盒说明书操作，每个浓度重复3次，200倍光学显微镜下观察。每张盖玻片上随机计数500个细胞，计数凋亡细胞数占细胞总数的比率，即凋亡指数（apoptosis index，AI），计算公式：AI（％）=（凋亡细胞数/500）×100％。三、流式细胞仪（FcM）检测细胞凋亡率对数生长期人膀胱癌T24细胞调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，接种于25cm²细胞培养瓶，24小时细胞80％左右融合，收集对照组和分别经0.01、0.1、1、10μg/ml的羟基喜树碱处理48 h的人膀胱癌T24细胞，PI单染后流式细胞仪下检测。每个浓度重复3次，每次计数10⁴个细胞。采用CELL QUEST软件进行DNA含量分析，以G₀/G₁峰前出现的亚二倍体细胞数量占细胞总数的百分率表示凋亡率。四、Western Blot检测Bcl-2蛋白含量变化收集对照组和羟基喜树碱（1μg/ml）处理48 h的人膀胱癌T24细胞，提取细胞总蛋白。酚试剂法对提取的蛋白样品进行定量。细胞总蛋白作Bcl-2蛋白含量分析。每个样本重复3遍。细胞总蛋白以β-actin作内参照。采用Fluorchem v2.0凝胶成像分析软件（美国Alpha公司）对条带进行灰度扫描，以平均灰度和条带面积的乘积代表信号强度，以目的条带和内参照灰度的比值表示蛋白含量。五、结果判定和统计学分析实验所得数据以（?）±s表示，均数比较采用独立样本t检验或单因素方差分析q检验。百分率样本值先进行平方根反正弦转换后再进行检验。结果一、羟基喜树碱对T24细胞存活率的影响随羟基喜树碱浓度增加，A₄₉₀值逐渐降低，人膀胱癌T24细胞存活率逐渐下降。存活率与羟基喜树碱浓度呈明显负相关（r=-0.916，P<0.05）。二、TUNEL法进行细胞凋亡的形态学观察TUNEL法染色可见阳性细胞萎缩，胞核呈棕黄或棕褐色，胞浆可因胞核内染色质泄露而淡染，部分凋亡细胞萎缩成球形。200倍显微镜下，对照组仅可见极少阳性细胞，羟基喜树碱处理组阳性细胞数明显增多。对照组和1μg/ml羟基喜树碱处理组的AI分别为0.56％、22.32％，组间差别均有显著性（P<0.05）。三、凋亡率检测随羟基喜树碱浓度增加，FCM检测人膀胱癌T24细胞凋亡率逐渐增加。对照组和0.01、0.1、1、10μg/ml的羟基喜树碱处理组凋亡率分别为0.96％、12.17％、19.38％、31.82％、47.12％。0.01、0.1、1、10μg/ml的羟基喜树碱处理组凋亡率与对照组相比显著升高（P均<0.01）。四、羟基喜树碱对人膀胱癌T24细胞Bcl-2蛋白含量变化的影响羟基喜树碱对Bcl-2蛋白含量的影响：对提取的细胞总蛋白进行Western Blot检测发现，对照组和羟基喜树碱处理组均有Bcl-2蛋白表达，但羟基喜树碱处理组表达水平与对照组无明显差异，差异不具有显著性（P>0.05）。结论羟基喜树碱具有促进人膀胱癌T24细胞凋亡的作用，其促凋亡作用具有剂量依赖性，这为进一步了解膀胱癌细胞凋亡信号的转导和羟基喜树碱的生物学作用提供了实验依据和理论基础。