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口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的主要侵害偶蹄类动物的一种人兽共患传染病。口蹄疫的爆发不仅给畜牧业带来巨大损失,而且还造成一系列社会问题。本研究对三株口蹄疫病毒分离株(NEW株、SZ株和LA株)进行全基因组序列测定,通过细胞中和试验和反向间接血凝试验鉴定其血清型,又在此基础上构建VP1基因的原核表达质粒并进行表达和验证,为研究口蹄疫病毒的基因结构与功能、抗原变异和开发新型疫苗等奠定基础。
基因组序列分析显示:NEW株与Asia Ⅰ/Jiangsu/China/2005株核苷酸序列相似性最高,达98%,属于Asia Ⅰ型毒株;SZ株与Tau-YuanTW97株核苷酸序列相似性最高,达93%,属于O型的Cathay型毒株;LA株与WFL株核苷酸序列相似性最高,达96%,也属于O型的Cathay型毒株。NEW株完整基因组全长8,233bp,其中S片段长366bp,Poly(C)区含有9个C,PKs和CRE长255bp,IRES长456bp,L基因长603bp,VP4基因长255bp,VP2基因长654bp,VP3基因长657bp,VP1基因长627bp,2A基因长54bp,2B基因长462bp,2C基因长954bp,3A基因长459bp,3B基因长213bp,3C基因长639bp,3D基因长1,410bp,3’UTR长93bp,Poly(A)尾长64bp。SZ株完整基因组全长8,156bp,其中S片段长371bp,Poly(C)区含有14个C,PKs和CRE长213bp,IRES长458bp,VP3基因长660bp,VP1基因长633bp,3A基因长429bp,3’UTR长92bp,Poly(A)尾长39bp,其它和NEW株相同。LA株完整基因组全长8,172bp,其中Poly(C)区含有12个C,PKs和CRE长21lbp,3’UTR长93bp,Poly(A)尾长58bp,其它和SZ株相同。
血清型鉴定结果表明:口蹄疫A型和C型标准血清对三个毒株的中和指数均<10;Asia Ⅰ型标准血清对NEW株的中和指数>50,对SZ株和LA株的中和指数均<10;O型标准血清对NEW株的中和指数<10,对SZ株和LA株的中和指数均>50。NEW株只能致口蹄疫Asia Ⅰ型敏化红细胞发生凝集,而SZ株和LA株都只能致口蹄疫O型敏化红细胞发生凝集。因而判定,NEW株为Asia Ⅰ型毒株,SZ株和LA株为O型毒株。
基因表达结果表明:本实验成功构建VP1基因的原核表达质粒,这些重组质粒转化大肠杆菌Rosetta 2(DE3)plysS表达出VP1融合蛋白,经SDS-PAGE和WesternBlot检测,表明VP1基因片段在大肠杆菌Rosetta 2(DE3)plysS中得到了表达。