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多蛋白桥梁因子MBF1（Multiprotein Bridging Factor 1）是真核生物广泛存在的、进化保守的转录辅激活因子。已有的报道显示，MBF1主要通过桥联转录激活因子和TBP（TATA-Binding Protein）调控各种胁迫应答基因的转录，并影响细胞和个体生物对环境胁迫的应答。已有的报道还显示，MBF1在调控高等生物应答干旱等胁迫中扮演着重要角色，但有关低等真核生物MBF1 的研究报道还不多，只有个别生物MBF1与转录激活因子关系的研究，还没有MBF1调控低等真核生物应答Cu2+胁迫的报道，也没有14-3-3蛋白调控MBF1胁迫应答功能的研究报道。PMBF1（Physarum MBF1）是本课题组在研究低等真核古生物多头绒泡菌（Physarum polycephalum）14-3-3蛋白时发现的P14-3-3（Physarum 14-3-3）相关蛋白，但是14-3-3蛋白如何调控MBF1胁迫应答功能还没有报道。
本研究以多头绒泡菌PMBF1 和酵母Mbf1p为研究对象，利用基因重组技术研究了PMBF1的胁迫应答功能，利用基因敲除技术制备了MBF1P基因缺失酵母株mbf1pΔ，用mbf1pΔ构建了表达PMBF1的酵母株mbf1pΔ+pPMBF1，通过双向电泳、质谱（2D-MS）检测和转录组分析研究了MBF1在Cu2+胁迫下的调控作用，获得了酵母受PMBF1、Mbf1p调控的蛋白以及受Cu2+胁迫影响的基因，分析了Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答基因所在的信号通路。前人在研究中曾发现酵母Mbf1p与其14-3-3蛋白Bmh1、Bmh2存在相互作用，本课题组在前期研究中发现PMBF1是P14-3-3相互作用蛋白。为了解14-3-3蛋白对MBF1胁迫应答功能的影响，本研究研究了PMBF1与P14-3-3、Mbf1p与Bmh1及Bmh2相互作用的位点，利用基因敲除技术制备了基因缺失酵母，利用基因重组技术制备了过表达和补救表达酵母，检测了其对酵母胁迫能力的影响。研究结果显示：
1、PMBF1能提高大肠杆菌耐受NaCl胁迫的能力，能提高酵母耐受Cu2+、热和氧化胁迫的能力，说明PMBF1 具有与酵母Mbf1p类似的胁迫应答功能，是保守的MBF1家族成员。2D-MS检测结果显示，在Cu2+胁迫下，表达上调的酵母蛋白主要与代谢有关，表达下调的蛋白主要与胁迫应答有关，说明酵母会通过提高代谢补偿应对Cu2+胁迫对应答能力的损害；Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答蛋白与基因复制、转录、翻译、糖代谢、信号转导、胁迫应答等途径或通路密切相关。其中过氧化物酶体通路是酵母Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答的主要通路，说明酵母应答Cu2+胁迫的过程受Mbf1p广泛调控。
2、为了深入了解Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答机理，本研究检测了Mbf1p基因缺失和Cu2+胁迫对酵母转录组的影响，发现567个受Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答基因。其中，120个基因在Mbf1p缺失时和Cu2+胁迫下表达都上调，447个基因表达都下调。与2D-MS检测结果一致，这些基因主要富集在DNA复制、转录调控、核糖核蛋白体的大小亚基组分以及氧化磷酸化等通路上。其中，氧化磷酸化通路可能是Mbf1p调控的主要通路之一，细胞色素C氧化酶亚基I（COX I）可能是Cu2+和Mbf1p协同作用的关键位点，说明氧化作用是Cu2+胁迫对酵母造成的主要伤害，氧化磷酸化是受Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答重要途径。
3、蛋白质相互作用检测结果显示，ILe78是影响PMBF1与P14-3-3作用的关键氨基酸，Ser190是影响P14-3-3与PMBF1作用的关键磷酸化位点。Mbf1p与Bmh1间存在相互作用，但Mbf1p与Bmh2间不存在相互作用。Pro107是影响Mbf1p与Bmh1作用的关键氨基酸。关键作用位点都是疏水氨基酸（ILe78和Pro107）是PMBF1和Mbf1p与其14-3-3蛋白作用的共同特征。
4、过表达P14-3-3，会提高酵母对高温的敏感性；缺失Bmh1或Bmh2基因，会提高酵母耐热胁迫能力，补救P14-3-3基因又可以恢复酵母mbf1pΔ+rad24Δ对高温胁迫的敏感性，说明P14-3-3具有与酵母14-3-3蛋白类似的功能。
5、补救PMBF1基因不仅能恢复Mbf1p基因缺失酵母的耐热能力，还能恢复 Mbf1p 与 Bmh1 双基因缺失酵母的耐热胁迫能力，而且会提高双基因缺失酵母的耐热能力。此外，补救PMBF1基因还能恢复Mbf1p基因缺失酵母的耐氧化能力，说明PMBF1具有与Mbf1p类似的调控胁迫应答的功能。
6、PMBF1和P14-3-3基因双补救不仅能恢复Mbf1p和Bmh1基因双缺失酵母的耐热能力，其耐热能力甚至高于对照酵母，说明 MBF1 对胁迫应答的调控是MBF1与14-3-3蛋白相互作用的结果，MBF1的功能受14-3-3蛋白调节。
本文的研究结果为深入理解 MBF1 调控低等真核生物胁迫应答的机理，了解14-3-3蛋白对MBF1调控胁迫应答的调节作用奠定了一定基础。对提高真核微生物的胁迫应答能力和生存能力，提高其应用价值提供了理论基础。
本研究以多头绒泡菌PMBF1 和酵母Mbf1p为研究对象，利用基因重组技术研究了PMBF1的胁迫应答功能，利用基因敲除技术制备了MBF1P基因缺失酵母株mbf1pΔ，用mbf1pΔ构建了表达PMBF1的酵母株mbf1pΔ+pPMBF1，通过双向电泳、质谱（2D-MS）检测和转录组分析研究了MBF1在Cu2+胁迫下的调控作用，获得了酵母受PMBF1、Mbf1p调控的蛋白以及受Cu2+胁迫影响的基因，分析了Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答基因所在的信号通路。前人在研究中曾发现酵母Mbf1p与其14-3-3蛋白Bmh1、Bmh2存在相互作用，本课题组在前期研究中发现PMBF1是P14-3-3相互作用蛋白。为了解14-3-3蛋白对MBF1胁迫应答功能的影响，本研究研究了PMBF1与P14-3-3、Mbf1p与Bmh1及Bmh2相互作用的位点，利用基因敲除技术制备了基因缺失酵母，利用基因重组技术制备了过表达和补救表达酵母，检测了其对酵母胁迫能力的影响。研究结果显示：
1、PMBF1能提高大肠杆菌耐受NaCl胁迫的能力，能提高酵母耐受Cu2+、热和氧化胁迫的能力，说明PMBF1 具有与酵母Mbf1p类似的胁迫应答功能，是保守的MBF1家族成员。2D-MS检测结果显示，在Cu2+胁迫下，表达上调的酵母蛋白主要与代谢有关，表达下调的蛋白主要与胁迫应答有关，说明酵母会通过提高代谢补偿应对Cu2+胁迫对应答能力的损害；Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答蛋白与基因复制、转录、翻译、糖代谢、信号转导、胁迫应答等途径或通路密切相关。其中过氧化物酶体通路是酵母Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答的主要通路，说明酵母应答Cu2+胁迫的过程受Mbf1p广泛调控。
2、为了深入了解Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答机理，本研究检测了Mbf1p基因缺失和Cu2+胁迫对酵母转录组的影响，发现567个受Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答基因。其中，120个基因在Mbf1p缺失时和Cu2+胁迫下表达都上调，447个基因表达都下调。与2D-MS检测结果一致，这些基因主要富集在DNA复制、转录调控、核糖核蛋白体的大小亚基组分以及氧化磷酸化等通路上。其中，氧化磷酸化通路可能是Mbf1p调控的主要通路之一，细胞色素C氧化酶亚基I（COX I）可能是Cu2+和Mbf1p协同作用的关键位点，说明氧化作用是Cu2+胁迫对酵母造成的主要伤害，氧化磷酸化是受Mbf1p调控的Cu2+胁迫应答重要途径。
3、蛋白质相互作用检测结果显示，ILe78是影响PMBF1与P14-3-3作用的关键氨基酸，Ser190是影响P14-3-3与PMBF1作用的关键磷酸化位点。Mbf1p与Bmh1间存在相互作用，但Mbf1p与Bmh2间不存在相互作用。Pro107是影响Mbf1p与Bmh1作用的关键氨基酸。关键作用位点都是疏水氨基酸（ILe78和Pro107）是PMBF1和Mbf1p与其14-3-3蛋白作用的共同特征。
4、过表达P14-3-3，会提高酵母对高温的敏感性；缺失Bmh1或Bmh2基因，会提高酵母耐热胁迫能力，补救P14-3-3基因又可以恢复酵母mbf1pΔ+rad24Δ对高温胁迫的敏感性，说明P14-3-3具有与酵母14-3-3蛋白类似的功能。
5、补救PMBF1基因不仅能恢复Mbf1p基因缺失酵母的耐热能力，还能恢复 Mbf1p 与 Bmh1 双基因缺失酵母的耐热胁迫能力，而且会提高双基因缺失酵母的耐热能力。此外，补救PMBF1基因还能恢复Mbf1p基因缺失酵母的耐氧化能力，说明PMBF1具有与Mbf1p类似的调控胁迫应答的功能。
6、PMBF1和P14-3-3基因双补救不仅能恢复Mbf1p和Bmh1基因双缺失酵母的耐热能力，其耐热能力甚至高于对照酵母，说明 MBF1 对胁迫应答的调控是MBF1与14-3-3蛋白相互作用的结果，MBF1的功能受14-3-3蛋白调节。
本文的研究结果为深入理解 MBF1 调控低等真核生物胁迫应答的机理，了解14-3-3蛋白对MBF1调控胁迫应答的调节作用奠定了一定基础。对提高真核微生物的胁迫应答能力和生存能力，提高其应用价值提供了理论基础。