青蒿琥酯上调神经酰胺抑制肝星状细胞纤维发生的作用

来源 :天津医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yeshenshi1
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目的本研究探讨了青蒿琥酯及神经酰胺对培养活化的HSCs增殖和MMPs水平的影响以及青蒿琥酯可通过上调神经酰胺抑制HSCs纤维发生的作用机理。方法采用SPF级Wistar健康雄性大鼠,原位灌注无钙灌流液冲去肝脏血液后游离肝脏,0.8 mg/mL链霉蛋白酶和0.5 mg/mL胶原酶灌流消化肝脏,细胞悬液经8%、12%和18%Nycodenz密度梯度离心,收集8%与12%的梯度界面的HSCs,调整适宜浓度接种培养,倒置相差显微镜下观察新鲜分离的细胞形态和生长特征。分离的大鼠肝星状细胞于培养瓶中原代培养10d,细胞培养活化。活化状态的HSCs分别设置对照组、青蒿琥酯及神经酰胺实验组分别作用24、48、72 h后,四甲基偶氮唑盐法检测药物对HSCs抑制情况;消化法测定细胞培养上清液中羟脯氨酸浓度,明胶酶谱法检测肝星状细胞MMP-2和MMP-9水平/活性,Western Blot检测对肝星状细胞MMP-13表达,HPLC-FLD测定细胞培养上清液中的神经酰胺含量。结果1.肝星状细胞的分离与培养:倒置相差显微镜观察新分离的HSCs呈球形,折光性强,悬浮于培养液中。培养10 d后,HSCs已充分展开,细胞呈星形或多边形,细胞内颗粒明显减少。生长曲线显示肝星状细胞培养72 h后开始增殖,第4、5天进入对数生长期,第6、7天进入平台期。2. MTT法检测青蒿琥酯及神经酰胺对HSCs增殖的影响:125、150、175、200、225μmol/L青蒿琥酯及10μmol/L神经酰胺分别作用24、48、72h后,与对照组比较,青蒿琥酯各浓度组、神经酰胺组分别对HSCs抑制率具有统计学意义(P< 0.05),其中青蒿琥酯组随着浓度的增加、作用时间的延长而增强(F=9.32,P<0.05),提示青蒿琥酯抑制HSCs增殖呈浓度及时间依赖性;而神经酰胺(10μmol/L)对HSCs增殖的抑制作用随着时间的延长而增强(F=108.79,P 0.05)。3.测定细胞培养上清液中羟脯氨酸含量:150、175、200 μmol/L青蒿琥酯,10 μmol/L神经酰胺,150 μmol/L青蒿琥酯和10 μmol/L神经酰胺分别作用HSCs 24 h后,发现青蒿琥酯各浓度组及神经酰胺组均能有效地降低培养活化的HSCs上清液中Hyp含量,与对照组比较,差异具有统计学意义(P< 0.05),青蒿琥酯和神经酰胺合用组与相应浓度的青蒿琥酯、神经酰胺组比较有下降趋势,但差异无统计学意义,说明青蒿琥酯及神经酰胺可使HSCs胶原蛋白的产生/分泌减少。4.酶谱法检测MMP-2和MMP-9的表达:上述各浓度药物分别作用HSCs 24 h后,与对照组比较,各给药组MMP-2表达减少,差异具有统计学意义(P<0.05),青蒿琥酯和神经酰胺合用组与相应浓度的青蒿琥酯组比较,差异也具有统计学意义(P<0.05),也检测到少量MMP-9表达,但与对照组比较无统计学差异。5. Western Blot检测MMP-13的表达:上述各浓度药物分别作用HSCs 24 h后,各浓度青蒿琥酯实验组MMP-13蛋白表达与对照组比较增加,差异有统计学意义(P<0.05)。青蒿琥酯和神经酰胺合用组与单独用药组比较,MMP-13的表达有上升趋势,但未见统计学差异。6. HPLC-FLD法测定细胞培养上清液中的神经酰胺含量:成功建立了该测定方法,绘制标准曲线为:y=1.3306×105x+2592.3, r=0.9999。利用该方法测定细胞培养上清液中的神经酰胺含量,200、300、400、500 μmol/L青蒿琥酯实验组,与对照组比较,差异具有统计学意义(P< 0.05),随着青蒿琥酯浓度的升高,各给药组HSCs细胞培养上清液中神经酰胺的含量逐渐升高(F=76.64,P< 0.05)。1、1.5、2 μmol/L油酰乙醇胺,与溶媒对照组比较,差异有统计学意义(P < 0.05),随着油酰乙醇胺浓度的增加,各给药组神经酰胺的含量逐渐升高(F=36.02, P< 0.05)。100、200、400 μmol/L青蒿琥酯与2 μmol/L油酰乙醇胺合用实验组,与溶媒对照组比较,差异有统计学意义(P< 0.05),其中100、200μmol/L青蒿琥酯分别与2 μmol/L油酰乙醇胺合用组,和相应浓度的青蒿琥酯组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。100、200、400 μmol/L青蒿琥酯分别与2 μmol/L油酰乙醇胺合用组,和2μmol/L油酰乙醇胺组比较,未见统计学差异。结论1.大鼠原代肝星状细胞分离培养成功。2.本研究建立了柱前衍生化与HPLC-FLD相结合的方法测定生物样品肝星状细胞培养上清液中神经酰胺的含量。3.青蒿琥酯通过上调HSCs神经酰胺含量,抑制HSCs增殖,从而降低MMP-2的水平及活性,增加MMP-13的表达,降低细胞上清液中羟脯氨酸含量,抑制胶原为主的ECM的产生而发挥了抑制纤维发生作用。
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