研究背景男性尿道狭窄是困扰泌尿外科医师的棘手疾病之一。尿道损伤是引起尿道狭窄形成的一个重要始发因素,深入研究尿道损伤后纤维性修复及瘢痕形成的分子学机制,进而采取针对性的、早期、有效而稳定的干预措施是临床上尿道狭窄治疗中亟需解决的关键问题。组织损伤修复是一个复杂的、动态的、多细胞参与的病理过程,巨噬细胞（Macrophage,Mφ）和成纤维细胞是肉芽组织中很重要的两种细胞类型,全程参与到组织损伤修复过程中。瘢痕组织的形成离不开成纤维细胞的增殖、细胞外基质的分泌与堆积两个重要环节,同时成纤维细胞发挥生物学作用可受到损伤后局部炎症微环境中Mφ的调控,此外Mφ受到微环境的改变可极化为M1φ和M2φ而发挥不同的作用,共同参与到不同阶段的组织损伤修复过程中。尿道损伤后局部微环境中Mφ的变化规律是怎样的,又是如何调控成纤维细胞在纤维性修复中发挥作用的值得进一步研究,有利于深入地解码尿道损伤后纤维性修复这一病理性过程。外泌体（Exosome,Exo）是实现细胞间通讯的一种重要介质,具有很高的临床转化价值的潜力。成纤维细胞除了能够受到Mφ分泌的细胞因子的刺激之外,还可以作为Mφ源性Exo（Mφ-Exo）的靶细胞,Mφ-Exo中的活性物质,如mi RNA被成纤维细胞摄入后可引起相应生物学功能的改变,继而影响到损伤后纤维性修复的结局,外泌体实现了Mφ与成纤维细胞的交互。本研究将从三个部分来探究Mφ及Mφ-Exo在尿道损伤修复中的作用及机制,为尿道损伤后纤维瘢痕形成的防治提供些许线索和思路。研究目的1.明确Mφ在尿道损伤后局部浸润的自然变化特点及对损伤后纤维性修复的作用。2.明确外泌体在M0φ/M1φ/M2φ调控成纤维细胞发挥生物学效应中作为细胞间通信介质的作用及对尿道损伤后纤维性修复结局的影响。3.探讨M2φ源性外泌体促进成纤维细胞纤维化并参与尿道损伤后纤维性瘢痕形成的分子机制。研究方法1.利用SD雄性大鼠制作尿道损伤模型。损伤后第1、3、5、7、14、21、28天分别留取损伤部位的尿道组织标本进行PCR和免疫荧光实验检测M0φ、M1φ和M2φ标志物的表达,继而明确Mφ在组织损伤修复过程中的自然变化特点。损伤后第1、3、5、7、9和14天尾静脉注射Mφ消耗剂Clodronate Liposomes（PBS Liposome作为对照）,在治疗第7天,留取部分组织标本,利用CD68免疫组化标记组织中Mφ以评价Clodronate Liposomes体内Mφ的清除效率,第28天利用PCR实验和Western-blot检测尿道损伤部位纤维化标志物Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1的m RNA表达和蛋白水平,Masson染色评价组织的纤维化程度,以探究Mφ在尿道损伤后纤维性修复中的作用。2.佛波酯诱导THP-1细胞向M0φ极化,LPS+IFN-γ诱导M0φ向M1φ极化;IL-4+IL-13诱导M0φ向M2φ极化,流式检测、免疫荧光和Western-blot进行表型鉴定。M0φ、M1φ和M2φ通过Transwell培养板与成纤维细胞共培养,观察M0φ、M1φ和M2φ对成纤维细胞的作用效应。利用GW4869可以抑制外泌体分泌的药理作用,对M0φ、M1φ和M2φ给予GW4869预处理,来探究M0φ、M1φ和M2φ源性外泌体（M0φ-Exo、M1φ-Exo和M2φ-Exo）在Mφ对成纤维细胞发挥效应中的作用。此外,使用低温差速超速离心法提取M0φ、M1φ和M2φ培养上清中的外泌体,通过电镜、纳米颗粒追踪分析和Western-blot膜蛋白鉴定。M0φ-Exo、M1φ-Exo和M2φ-Exo培养成纤维细胞,通过PCR实验和Western-blot检测尿道损伤部位纤维化标志物Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1的m RNA表达和蛋白水平,Ed U实验检测对成纤维细胞增殖的影响。SD大鼠尿道损伤中后期给予腹腔注射GW4869（注射同体积剂量的DMSO作为对照）来探究Exo抑制后对组织损伤修复的影响,通过免疫荧光和Western-blot验证尿道组织损伤部位外泌体抑制效果,Western-blot和Masson染色检测纤维化标志蛋白的表达情况和纤维化程度来探究外泌体在尿道损伤修复中的作用价值。3.通过外泌体mi RNA测序技术获取M2φ-Exo中mi RNA表达谱,对M2φ-Exo中上调前10的mi RNA在新提取的M0φ-Exo,M1φ-Exo和M2φ-Exo中通过PCR进行验证。根据文献报道和生物信息学分析筛选研究的目标mi RNA及其靶m RNA,荧光素酶报告基因验证生物信息学分析预测的mi RNA和m RNA的靶向关系。通过成纤维细胞转染目标mi RNA mimic后检测细胞纤维化标志物的表达,对实验分组:空白对照组、mi RNA mimic、mi RNA mimic NC;另外,为了更好地明确M2φ-Exo可以通过释放mi RNA促进纤维化,使用M2φ-Exo和mi RNA inhibitor同时处理成纤维细胞,观察M2φ-Exo促进纤维化的效应会不会减弱,实验分组:M2φ-Exo、M2φ-Exo+mi RNA inhibitor、M2φ-Exo+mi RNA inhibitor NC,Western-blot实验,PCR分析不同组间纤维化标志物的表达。最后在人体尿道狭窄组织标本中进行分子通路的初步验证实验。研究结果1.尿道损伤后Mφ浸润呈现M1φ/M2φ时序性极化的变化规律并在尿道损伤后纤维性修复中起到重要作用。（1）尿道损伤后创伤部位的Mφ变化呈现一定的时间变化规律,损伤后3天内炎症、水肿最甚,此时浸润的Mφ也最多,损伤后5天内浸润的Mφ主要以M1φ为主,高表达CD86、i NOS,而7天左右M2φ的占比增加,高表达CD206,Arginase-1;尿道损伤后1个月左右损伤部位局部出现瘢痕的形成,并出现排尿困难的表现,出现上尿路积水、膀胱结石。（2）损伤3天内,局部组织炎性水肿严重,Collagen I,Collagen III,α-SMA和TGF-β1的表达低于正常对照组,说明这个阶段处于组织破坏阶段。随着损伤后时间的推移Collagen I,Collagen III,α-SMA和TGF-β1的表达逐渐增加,Masson染色也显示随着时间推移损伤部位纤维化程度逐渐增加,说明局部组织正在进行纤维性修复的过程。（3）使用Clodronate Liposomes后可以消耗肝脏、肺部、肠道和尿道损伤部位中的Mφ,Mφ消耗之后不利于尿道损伤后伤口纤维性修复,纤维化标志物表达水平降低,纤维化程度轻,结果说明Mφ对尿道损伤后纤维性修复起到很重要的作用。2.M2φ-Exo促进成纤维细胞增殖和纤维化改变,促进了尿道损伤后纤维性修复。（1）流式细胞、Western-blot、免疫荧光结果均表明使用的诱导方案可以成功将THP-1细胞诱导成M0φ（表达CD68）,M1φ（表达CD86和i NOS）和M2φ（表达CD206和Arginase-1）。此外,GW4869和DMSO处理后不会引起M0φ、M1φ和M2φ表型发生改变。（2）M0φ、M1φ和M2φ培养上清通过低温差速超速离心后获得的沉淀高表达Alix、CD9、CD81,不表达Calnexin,电镜下观察形如盘状的囊泡,直径在100 nm左右,表明提取出来的沉淀是外泌体。此外,GW4869处理后的Mφ会减少Mφ-Exo的分泌。细胞内化实验表明Mφ-Exo可以被成纤维细胞摄取。转染CY3-mi RNA的Mφ与成纤维细胞共培养,成纤维细胞核周围可检测到红色荧光物质,而GW4869预处理转染了CY3-mi RNA的Mφ后与成纤维细胞共培养,成纤维细胞中几乎没发现红色荧光的存在,结果证明Mφ中的mi RNA可以通过外泌体转移到成纤维细胞中及外泌体的分泌可以被GW4869抑制。（3）M0φ-Exo、M1φ-Exo和M2φ-Exo分别与成纤维细胞共培养,发现M2φ-Exo有增加成纤维细胞纤维化标志物的表达和促进增殖的作用。此外,M0φ、M1φ和M2φ分别与成纤维细胞共培养,发现与M2φ共培养的成纤维细胞中Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1表达增加,增殖能力提高。当M2φ受到GW4869处理后这种效应会减弱,这提示M2φ-Exo可以促进成纤维细胞的纤维化和增殖。（4）体内实验通过免疫荧光检查发现GW4869组CD206阳性细胞周围Alix、CD9表达要低于DMSO组。说明组织内Mφ-Exo的分泌受到抑制。此外,我们发现GW4869组中Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1的表达和局部纤维化程度要低于DMSO组,提示外泌体在尿道损伤纤维性修复过程中起到促进作用。3.M2φ-Exo富含mi R-34a-5p,通过Exo传递于成纤维细胞,降低成纤维细胞中SIRT1的表达促进纤维化（1）通过Exo-mi RNA测序,PCR验证,以及生物信息学分析,最终发现M2φ-Exo中的mi R-34a-5p表达增加并参与细胞纤维化过程,因此将该mi RNA作为研究目标。（2）荧光素酶报告基因证明mi R-34a-5p可特异性结合SIRT1,影响SIRT1的表达。（3）转染mi R-34a-5p mimic的成纤维细胞中Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1升高,而SIRT1表达相对降低。另外,M2φ-Exo处理转染mi R-34a-5p inhibitor的成纤维细胞后Collagen I、Collagen III、α-SMA和TGF-β1的表达相对降低,而SIRT1相对增高。（4）进一步人体标本发现尿道瘢痕组织中mi R-34a-5p表达增高,而SIRT1表达降低,提示mi R-34a-5p/SIRT1参与了尿道狭窄瘢痕形成过程。研究结论首先该研究明确了Mφ在尿道损伤后局部浸润的自然变化规律,尿道损伤修复的早期以M1φ浸润为主,参与组织的促炎抗感染的作用,中后期Mφ的浸润以M2φ为主,参与抗炎促进修复的作用,进一步也证明了Mφ的这种动态变化特点对尿道损伤修复是至关重要的,局部缺乏Mφ的浸润将阻碍尿道损伤后的纤维性修复过程;其次,该研究发现了M2φ源性外泌体可作为细胞间通信介质作用于成纤维细胞,促进成纤维细胞的增殖和纤维化改变,参与尿道损伤中后期纤维性修复,但同时也引起了纤维瘢痕的形成,基于此在损伤中后期抑制M2φ源性外泌体的分泌可减少纤维瘢痕粘连形成,该发现为临床干预尿道损伤后纤维瘢痕形成提供了些许思路;最后,研究发现M2φ-Exo可将外泌体中富含的mi R-34a-5p转运至成纤维细胞中沉默SIRT1的翻译继而促进成纤维细胞纤维化改变是尿道损伤后纤维性修复、瘢痕形成的潜在机制。