重组人肠三叶因子对烧伤后肠上皮细胞和上皮内淋巴细胞免疫功能影响的实验研究

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目的:观察重组人肠三叶因子(recombinant human intestinal trefoil factor,rhITF)对烧伤后肠上皮细胞和上皮内淋巴细胞免疫功能的影响并探讨其可能的机制。方法:1.重组人肠三叶因子对烧伤血清所致肠上皮细胞免疫功能变化的影响采用大鼠小肠上皮细胞株IEC-6传代培养模型,在正常IEC-6和烧伤血清损伤的IEC-6两个层面观察rhITF对其免疫功能的影响。在第一层面,将细胞分为正常对照(control,C)组、rhITF(I)组、黏蛋白(mucin,M)组和rhITF加黏蛋白(I+M)组,培养条件分别为常规培养(DMEM+10%小牛血清)、常规培养+25μg/ml rhITF、常规培养+250μg/ml黏蛋白以及常规培养+25μg/ml rhITF+250μg/ml黏蛋白。在第二层面,将细胞分为烧伤对照(burn,B)组、烧伤加rhITF(B+I)组、烧伤加黏蛋白(B+M)组和烧伤加rhITF和黏蛋白(B+I+M)组,培养条件与上述4组类似,不同之处是用10%烧伤大鼠血清替换10%小牛血清,其他条件不变。分别采用瑞氏吉姆萨染色法、细胞计数法和放射免疫法观察IEC与大肠杆菌黏附数量、细胞存活率以及分泌炎性介质能力的变化。2.重组人肠三叶因子对烧伤小鼠肠道上皮内淋巴细胞的影响体内实验将102只BALB/c小鼠随机分为正常对照(C)组,烧伤对照(B)组、rhITF低剂量(1mg/kg)组、rhITF中剂量(2.5mg/kg)组和rhITF高剂量(5mg/kg)组。C组只给予麻醉和剃毛,不予烧伤,其他4组小鼠给予80℃水浴烫伤20s,造成30%体表面积Ⅲ度烫伤。rhITF治疗组依据上述剂量每天分两次口服灌胃给药,B组灌胃等量生理盐水。观察时相为伤后1、3、5、7天,每组每时相6只小鼠。另外比较了纵切剪片法、黏膜刮取法和肠道翻转法三种处理方式分离肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte, IEL)的优劣,最终采用纵切剪片法分离、纯化IEL,并通过流式细胞仪检测TCRγδ+IEL和TCRαβ+IEL细胞比例,分析烧伤后IEL亚群变化规律及rhITF对其的影响。结果:1.肠三叶因子对烧伤血清所致肠上皮细胞免疫功能变化的影响(1)在烧伤血清的刺激下,B组IEC黏附细菌数量明显高于C组(P<0.01);与B组相比,B+I组和B+M组细菌黏附数量在0.5h、1h明显降低(P<0.05或P<0.01);联合用药的B+I+M组不仅在各时相点明显低于B组(P<0.01),在2h和3h明显低于B+I和B+M组(P<0.05或P<0.01)。(2) rhITF能增加烧伤血清刺激后IEC存活率,B+I组在作用1h和2h,B+M组在作用0.25h和0.5h时,细胞存活率明显高于B组(P<0.05或P<0.01);联合用药效果更佳,B+I+M组不仅明显高于B组(P<0.05或P<0.01),也明显高于另外两组。(3)在烧伤血清刺激下IEC分泌炎性介质(TNF-α、IL-6和IL-8)的能力明显增加(P<0.01)。给予rhITF能显著降低IEC分泌炎性介质的能力,其分泌量明显低于B组(P<0.05或P<0.01);B+M组与B组比较,差异无统计学意义(P>0.05);B+I+M组在各时相点不仅显著低于B组(P<0.01),也明显低于B+I组(P<0.05)。2.肠三叶因子对烧伤小鼠肠上皮内淋巴细胞的影响(1)通过比较获取细胞数量、纯度和活性以及耗时等4个方面的优劣,明确了纵切剪片法最优,后续实验均采用该方法分离IEL。(2)烧伤后肠道IEL亚群比例发生明显变化,与C组相比,B组小鼠肠道TCRγδ+IEL比例明显降低,而TCRαβ+IEL比例明显增加(P<0.05)。(3)给予不同剂量的rhITF能增加TCRγδ+IEL比例,同时降低TCRαβ+IEL比例,保持二者的平衡;在烧伤后1-7天都明显优于B组(P<0.05或P<0.01)且应用rhITF的最小有效剂量为1mg/kg。结论:(1)rhITF能增强肠上皮细胞抵御细菌黏附的能力,降低细胞死亡率,并能减轻烧伤血清的免疫刺激作用,维护肠上皮细胞免疫稳态,减少炎症介质释放。黏蛋白本身作用较弱,但能显著增强rhITF作用效果。(2)严重烧伤可导致肠道IEL亚群比例失调,TCRγδ+IEL比例显著下降,TCRαβ+IEL比例上升,给予rhITF能维护IEL亚群的稳定,有利于维护肠黏膜免疫稳态,其最小有效剂量为1mg/kg。
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