肺癌是一种常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均高居肿瘤前列。肺癌高死亡率的主要原因是发生转移。上皮细胞间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)使上皮来源的肿瘤细胞转化为间充质细胞,从而获得迁移和侵袭的能力。EMT是肿瘤转移的初始调节步骤,靶向于EMT的治疗策略具有抑制和阻断肿瘤转移的巨大潜力。TGF-β/Smad信号通路在EMT中起着关键作用。一旦结合TGF-β,II型受体激酶被磷酸化从而激活I型受体激酶(TGFBR1),随后导致Smad2/3磷酸化。TGF-β处理后,上皮标志物表达减少,而间充质标志物表达增强,且上皮细胞由多边形变为细长梭形。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)在肿瘤发生发展的各个方面中都发挥重要作用。Lnc RNAs被广泛认为通过调控临近或宿主基因发挥作用。虽然已有文献报道lnc RNAs参与TGF-β诱导的EMT,但对TGF-β信号途径的核心转录因子Smad3附近的lnc RNAs的研究甚少。因此,为了寻找参与经典TGF-β/Smad信号通路的lnc RNAs,本论文重点研究了Smad3附近的lnc RNAs。LINC02206位于Smad3上游10.9万个碱基处,我们将其命名为Smad3-associated long non-coding RNA(SMASR)。为了检测SMASR在TGF-β诱导的EMT中的表达,我们用TGF-β处理肺癌细胞株A549 24小时至72小时,使细胞获得EMT特性;随后的RT-q PCR检测发现,SMASR在TGF-β诱导的EMT模型中显著下降。此外,我们发现TGF-β短期刺激A594细胞也下调了SMASR的表达,这表明SMASR可能是TGF-β的直接下游靶点。为了确定经典的TGF-β/Smad信号通路是否参与SMASR的下调,我们分别使用两条si RNAs敲降A549细胞中Smad2或Smad3。RT-q PCR分析显示,敲降Smad2或Smad3均能导致SMASR表达增加。此外,敲降Smad2或Smad3后,TGF-β不再能够降低SMASR的表达,表明Smad2/3是TGF-β诱导SMASR下调所必需。为了探究Smad2/3是否能与SMASR基因启动子结合,我们用Smad2/3的抗体对TGF-β处理或未处理的A549细胞进行了染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验。结果表明,Smad2/3可以结合到SMASR基因启动子区,而且TGF-β处理进一步增加了这种结合。以上这些结果表明,SMASR是经典TGF-β/Smad信号通路的直接转录靶点。为了研究SMASR在EMT中的作用,我们首先用三条不同的sh RNAs稳定敲降A549细胞中的SMASR,建立SMASR稳定低表达细胞系。有趣的是,三条sh RNAs均能够诱导A549细胞的间充质样形态特征。我们分别采用RT-q PCR和Western blotting检测EMT标志物的m RNA和蛋白的表达情况,随后观察到敲降SMASR显著下降上皮标志物E-cadherin的表达,而增加间充质标志物N-cadherin、vimentin和ZEB1的表达。免疫荧光分析进一步表明,E-cadherin在SMASR敲降的细胞中表达下调。EMT能够诱导细胞迁移和侵袭,于是我们使用transwell小室研究了SMASR对细胞迁移或侵袭的影响。正如预期,SMASR沉默显著促进了A549细胞迁移和侵袭能力。接下来,我们同样在H1299细胞中稳定敲降SMASR,并得到了类似的实验结果。最后,我们获得了稳定高表达SMASR的A549细胞系。与敲降实验相反,过表达SMASR增加了E-cadherin的表达,但降低了Ncadherin的表达。此外,Transwell分析显示,过表达SMASR抑制了A549细胞的迁移和侵袭能力。以上结果表明,SMASR在肺癌EMT以及细胞迁移和侵袭中起着重要作用。为了探究SMASR调控EMT的分子机制,我们首先采用RNA原位杂交法(FISH)检测SMASR的亚细胞定位。结果显示,SMASR在A549细胞核和细胞质中均有分布。Lnc RNAs已被证实能够调节邻近基因的表达。因此,我们研究了SMASR是否影响其邻近基因Smad3。RT-q PCR和Western blotting实验结果显示,与对照细胞相比,SMASR敲降的A549细胞中Smad3的m RNA和蛋白含量都没有显著改变。然而,令我们惊讶的是,当敲降SMASR后,Smad3的磷酸化水平增加。为了进一步证实这一发现,我们进行了细胞核-质分离实验;Western blotting检测显示,Smad3的磷酸化水平在SMASR敲降的A549细胞核中明显增加。此外,敲降SMASR也促进了TGF-β诱导的Smad3磷酸化。为了验证SMASR是否通过Smad3在EMT中发挥作用,我们用si RNAs沉默SMASR稳定低表达A549细胞中的Smad3。结果表明,Smad3的缺失可显著逆转SMASR敲降引起的Ecadherin表达减少。这些数据表明,敲降SMASR能够促进Smad3的磷酸化,从而诱导了肺癌细胞发生EMT。由于Smad3及其下游分子在SMASR敲降细胞中被持续激活,我们推测Smad3的上游分子TGF-β或者TGFBR1可能参与了这一过程。因此,我们采用RT-q PCR和Western blotting检测敲降SMASR对TGF-β和TGFBR1表达的影响。结果表明,当SMASR在A549细胞中被稳定敲降时,TGF-β的m RNA表达水平没有显著变化,而TGFBR1的m RNA和蛋白表达水平均显著上调。这些数据表明,SMASR可能在m RNA水平上调节TGFBR1的表达。的确,用序列不同的2条si RNAs瞬时低表达SMASR也得到类似的结果。此外,与Smad3结果一致,我们发现,沉默TGFBR1也可以逆转SMASR敲降引起的E-cadherin表达减少。这些结果表明,TGFBR1参与了SMASR敲降诱导的EMT。为了探讨SMASR如何在m RNA水平上调节TGFBR1的表达,我们首先检查SMASR是否可以影响TGFBR1的m RNA稳定性。经RNA合成抑制剂放线菌素D处理后,我们观察到SMASR敲降对TGFBR1的半衰期没有显著影响。然后,我们使用RT-q PCR和其前体m RNA(pre-m RNA)引物检测了TGFBR1的前体m RNA含量。结果表明,敲降SMASR增加了TGFBR1的前体m RNA水平,提示SMASR可能抑制TGFBR1的转录。越来越多的研究表明,lnc RNAs可以通过直接与转录因子结合来调节基因转录。于是我们利用体外转录的生物素化SMASR进行了RNA-pull down实验。结果表明,SMASR可以和Smad3以及p-Smad3相互结合。截断体实验进一步证明,SMASR主要通过200-400nt的片段与Smad3相互结合。此外,我们还利用Smad3的抗体进行了RIP实验,证明Smad3可以结合内源性SMASR。因为Smad3是一个转录因子,且是SMASR的宿主基因,我们怀疑Smad3可能同样调控TGFBR1的表达。RT-q PCR和Western blotting实验结果显示,敲降Smad3也增强了A549或H1299细胞中TGFBR1的m RNA或蛋白的表达,而Smad3的过度表达则降低了TGFBR1的表达。这提示Smad3可能是TGFBR1的转录抑制因子,通过负反馈环抑制TGFBR1的转录。的确,敲降Smad3后,TGFBR1的前m RNA水平增加。随后的Ch IP实验证实,Smad3可以与TGFBR1的启动子结合,但敲降SMASR可以抑制这种结合。此外,同时下调Smad3和SMASR对A549细胞TGFBR1表达的增加没有协同作用。综上所述,这些发现提示,SMASR通过与Smad3相互结合,将Smad3招募到TGFBR1的启动子区,使Smad3成为TGFBR1转录的负反馈抑制因子。为了评估SMASR在肺癌中的表达,我们首先利用TCGA数据集分析肺癌中SMASR的表达水平。生物信息学分析显示,肺鳞状细胞癌和肺腺癌标本中SMASR的表达均低于相应正常标本。通过对GEO数据的分析,我们发现与癌旁组织相比,SMASR在大多数肺癌组织中表达下调。为了证实这一发现,我们用RNA原位杂交(ISH)实验检测了肺鳞状细胞癌组织芯片中SMASR的表达。与生物信息学分析的结果一致,我们观察到肺癌组织中SMASR表达水平显著低于癌旁组织。此外,Kaplan-Meier Plotter的分析结果显示,SMASR的低表达预示着肺鳞癌患者更差的总体生存率。综上所述,我们报道了一个邻近于Smad3的长链非编码RNA,由TGF-β通过Smad2/3诱导下调。敲降SMASR能够促进肺癌上皮细胞向间质转化,并促进其迁移和侵袭。此外,敲降SMASR能够促进Smad3的磷酸化。机制上,SMASR能与Smad3相互作用并抑制TGFBR1的转录,从而导致TGF-β信号通路的失活。我们的研究提示,在肺癌转移的EMT过程中存在TGFBR1-Smad3-SMASR这样一条负反馈环。SMASR可能是治疗肺癌转移的潜在分子。