保幼激素(Juvenilehormones,JHs)是一类倍半萜烯化合物,由昆虫咽侧体合成并分泌,调控昆虫生长、发育、变态和生殖。保幼激素的合成分为两个阶段:一是经典的甲羟戊酸途径,以乙酰辅酶A为底物合成法尼焦磷酸;二是节肢动物特有合成途径,以法尼焦磷酸为底物合成保幼激素。本文结合生物信息学和基因克隆技术获得12条保幼激素合成相关酶编码基因的全长cDNA序列,通过RNA干扰技术验证了LdJHAMT基因在JH合成过程中的关键作用,分析了甲羟戊酸途径酶编码基因响应于JH滴度的表达变化。本文的主要研究结果如下:1、马铃薯甲虫保幼激素合成酶基因分子克隆基于马铃薯甲虫转录组与基因组数据,我们获得11条保幼激素合成相关基因的EST序列,利用PCR技术,克隆到这11条基因的全长,分别编码:乙酰乙酰COA硫解酶(LdAACT1和LdAACT2)、3-羟甲基戊二酰COA合成酶(LdHMGS)、3-羟甲基戊二酰COA还原酶(LdHMGR1和LdHMGR2)、甲羟戊酸激(LdMevK)、磷酸甲羟戊酸激酶(LdPMK)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(LdMDD)、异戊烯焦磷酸异构酶(LdIDI)和法尼焦磷酸合成酶(LdFPPS)和保幼激素酸甲基转移酶(LdJHMAT)。多重序列比对和系统进化分析结果表明,这些基因编码蛋白具有典型的结构域和进化保守性。这暗示了 11条相关基因的鉴定结果的准确性。2、马铃薯甲虫JHAMT的功能分析保幼激素酸甲基转移酶JHAMT的甲基化反应是合成JH的最后步骤之一。我们分析了LdJHAMT基因的时空表达模式,发现LdJHAMT基因在每次蜕皮期间高表达,且在脑-咽侧体-心侧体复合体中特异性表达。利用大肠杆菌发酵构建了两个dsJHAMT干扰载体,在二龄和四龄分别喂食干扰。喂食两段dsJHAMT都成功的降低LdJHAMT的表达量,从而导致JH滴度下降,JH早期响应基因Kr-h1表达量下调。.二龄和四龄干扰LdJHAMT引起幼虫死亡、体重减小、发育期缩短和化蛹失败。同时,干扰LdJHAMT还引起羽化率下降,成虫体重下降而且不产卵。施加JH类似物吡丙醚能够回补LdJHAMT被干扰导致的所有异常表型。这证明LdJHAMT编码功能性的JHAMT酶,并可以作为防治马铃薯甲虫的靶标。3、马铃薯甲虫甲羟戊酸途径酶编码基因对保幼激素滴度的响应利用qRT-PCR技术分析了甲羟戊酸途径基因的时空表达谱。除LdAACT1外,其他九条基因都主要在脑-心侧体-咽侧体复合体、卵巢和精巢中表达。同时这九条基因在每次刚蜕皮后高表达,而在蜕皮之间低表达。据此我们猜想这九条基因可能参与到保幼激素的合成中。利用RNAi敲低保幼激素合成关键基因LdJHAMT从而降低JH滴度,这引起九条甲羟戊酸途径基因表达量的下调。注射JH激活JH通路也抑制这九条基因的表达。这表明干扰LdJHAMT引起JH前体的积累以及注射JH都会通过负反馈回路来抑制九条甲羟戊酸途径酶基因的表达,从而平衡合成酶的含量。