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本研究主要对小细胞性B-NHL(SBCLs)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)这两种B-NHL的VH基因结构进行比较，鉴别其VH基因的结构特点与淋巴瘤的发病、发展是否存在联系。
研究材料：收集1997-2005年我医学院附属医院及省内其它医院的B-NHL标本110例，其中SBCLs71例，DLBCL39例。全部标本经10％中性福尔马林固定、常规石蜡包埋、4～5μm连续切片、HE染色。
研究方法
(1)免疫组化。
采用CD20(L26)、CD45RA(4KB5)免疫组化S-P法标记39例DLBCL和71例SBCLs，明确诊断。CD23(M0763)、CD5(M7194)、CyclinD1(M7155)、IgD(M0703)、BCL-6(PG-B6P)、FDC(CNA42)标记SBCLs亚群。
(2)PCR扩增和克隆。
通过半巢式PCR扩增VH基因，上游引物为：tgga/gtccgc/acagg/cct/ct/ccngg(FR2A)；下游引物为：tgaggagacggtgacc(LJH)和gtgaccagggt(a/g/c/t)ccttggccccag(VLJH)。PCR过程中设立阳性对照和阴性对照：阳性对照是Raji细胞株，阴性对照为不加任何DNA模板的反应体系。所有病例的PCR产物均采用双向测序。
将琼脂糖凝胶电泳中的目的条带割胶纯化后进行TA克隆。每个样本至少随机挑选5个克隆进行测序分析。
(3)序列的分析方法。
运用NCBI的序列分析软件将我们的测序结果与胚系序列比对，分析其同源性。VH、DH、JH片段主要通过V-Base数据库和NCBI中的IgBlast软件进行界定。
(4)克隆内多样性的分析方法。
为了评价淋巴瘤是否存在持续超突变，每个样本至少挑选5个克隆进行测序。克隆内多样性的评价遵循以下标准：非恒定的突变，指的是仅仅在样本的单一克隆中出现的点突变；恒定突变，指的是在同一样本的两个以上克隆内均出现的点突变。只有恒定突变被认为是克隆内多样性的标记；非恒定突变则被认为是Taq聚合酶误配所引起。克隆内多样性的频率计算为：克隆内突变的核苷酸数目/(序列总的核苷酸数×选取的克隆数)。
(5)抗原选择的分析方法。
评价某一病例的SHM形式是否符合抗原选择特征有2种方法。一、分析互补决定区2(CDR2)和框架区3(FR3)区域的替代突变/沉默突变(R/S)比率。当CDR2中R/S大于2.9且FR3中的R/S小于1.5时，则认为这一序列的SHM符合抗原选择。二、仅仅考虑FR3中的R/S，即当FR3中R/S小于1.6便认为该序列符合抗原选择特征。
研究结果：
根据肿瘤的免疫表型和形态学特征，对71例SBCLs进行鉴别诊断，得到MALT37例，DLBCL伴MALT区域9例，FL7例，MCL9例，NMZL2例，SMZL3例，剩余4例未明确诊断。将明确诊断的MALT(共37例)、DLBCL伴MALT(9例)以及39例DLBCL病例全部行PCR扩增其VH片段，结果10例MALT和10例DLBCL成功扩增了IgVH基因的CDR2和FR3区域，并直接测序。将含有残留MALT成分的DLBCL病例分别扩增其两种细胞群的VH基因，并对成功扩增的病例进行克隆测序。1例DLBCL伴MALT的DLBCL细胞群和1例DLBCL伴MALT的MALT成分成功进行了克隆测序(讨论SHM频率时分别纳入DLBCL和MALT的范畴)。此外对单纯的4例MALT和5例DLBCL也进行克隆测序，分析其克隆内超突变情况。
(1)本研究的MALT病例中有7例使用了VH3基因家族，3例使用VH4基因家族。VH3基因家族的使用率高达64％，比正常外周血中VH3的使用率(50％)高。DLBCL中7例VH3，4例VH4-34。在这个仅仅10个病例构成的小样本中VH4-34基因的使用率达到36％，远远高于正常周围血液。但是尚需要扩大样本研究才能对DLBCL中是否存在VH4-34基因家族的偏向性下结论。依据Corbett等人提出的规则：至少有10个连续的核苷酸与公认的胚系D基因片段相吻合。我们的病例中可以识别出D片段的MALT和DLBCL病例各为5例。根据另外一条相对不那么严格的规则：至少有6个连续片段与胚系片段相吻合，或者7个片段吻合(中间可有一个不吻合)，则另外3例MALT和2例DLBCL也可以辨别出D片段。当病例的D片段与多个胚系D片段有高度同源性时，优先考虑与其后的JH片段有重叠的胚系D片段。我们病例的JH片段以JH5最常见，其中MALT中有5例，DLBCL中有4例，其次为JH4，JH6。
(2)以突变频率超过2％作为鉴定发生SHM的界线，所有的MALT和10例DLBCL病例均发生了SHM。剩余1例DLBCL与胚系序列的同源性＞98％，未发生SHM。在11例MALT中VH基因的突变频率介于2.38％-20.79％，平均为9.58％。DLBCL突变频率介于1.18％-13％，平均值为7.5％。对两组淋巴瘤的VH基因SHM频率的通过T检验发现不存在显著差异(P=0.227，t=1.246)。这些病例的SHM分析发现大部分的突变为点突变，但是也存在连续2个或3个核苷酸的替换，特别是在同一密码子内出现。此外在MALT病例7中还见到一处3个核苷酸的缺失片段。
(3)研究的22个病例均呈功能性VH重排，内部未见终止密码子，有编码免疫球蛋白的潜在功能。根据上面提到的两条规则，9例MALT和6例DLBCL呈现抗原选择。
(4)有1例DLBCL伴MALT病例的MALT细胞群克隆测序成功，分析显示它存在克隆内多样性，克隆内超突变的频率为0.35％。另1病例的DLBCL细胞群扩增成功，对其挑选了8个克隆进行测序，未发现克隆内SHM。此外还对4例MALT病例以及5例胃肠道DLBCL进行克隆测序。其中2例MALT(其中1例位于扁桃体)以及2例胃肠道DLBCL未见克隆内多样性，而另2例MALT和3例DLBCL存在克隆内多样性。
研究结论：
(1)本组实验中的MALT来自GC后B细胞，其超突变的平均频率为9.58％，比国外文献报道的4-4.5％要高。
(2)DLBCL存在多源性，即可以来自GC前、GC、以及GC后B细胞。
(3)MALT和DLBCL的SHM频率不存在明显差别。
(4)DLBCL伴MALT的病例中DLBCL可能是MALT持续SHM过程中所产生的某一个肿瘤细胞株优势增生而形成的，MALT中持续的克隆内SHM有可能是导致其向DLBCL转变的重要因素。
(5)抗原选择在大部分MALT和DLBCL病例的发生发展中起作用。