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目的：
肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae，S.pn) 是肺炎、脑膜炎、败血症等严重的侵袭性疾病的致病菌，也是流感继发致死性细菌感染的首要病原菌，可导致耳聋、瘫痪、智力低下等严重的后遗症。然而，目前临床可用的S.pn疫苗对其感染的保护效应并不理想。因此，迫切需要研发新型的S.pn疫苗。
研究显示，S.pn一些保守性好的毒力因子具有作为疫苗的潜能。肺炎链球菌锌金属蛋白酶B（ZmpB）作为一种毒力因子，既往的研究中发现ZmpB亚基是具有潜力的肺炎链球菌候选疫苗，但存在保守型相对较低，或与成人血清型反应较低的问题。我们发现ZmpB的一个新片段，即ZmpB的N末端的第673至863氨基酸（ZmpB673-863），不仅与健康人血清具有高反应性，而且在肺炎链球菌的不同血清型中保守性较高，可能是一种良好的肺炎链球菌疫苗候选蛋白。
佐剂是蛋白疫苗的重要组成部分，目前以TLRs配体为基础的疫苗佐剂是近年来的研究热点。肺炎链球菌内肽酶O（PepO）作为一种新发现的毒力蛋白和TLR2和TLR4的激动剂，具有促炎和增强巨噬细胞吞噬的作用，这提示PepO可能具有佐剂效应。
因此，本研究拟鉴定ZmpB673-863作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的可行性，并以其为疫苗抗原评估PepO的佐剂效应，为构建无需佐剂的新型肺炎链球菌蛋白疫苗提供可靠的实验依据。
方法：
通过原核表达的方式，经Ni2+柱纯化，获得肺炎链球菌ZmpB的N末端的第673至863氨基酸肽段（ZmpB673-863）、PepO蛋白(全长)、和融合蛋白ZmpB673-863-PepO、PepO-ZmpB673-863，进一步去除内毒素，然后皮下免疫C57BL/6小鼠制备相应的多克隆抗血清。通过PCR、Western blot和ELISA验证ZmpB673-863在肺炎链球菌不同血清型的保守性；并建立细胞模型验证ZmpB673-863抗血清的调理吞噬作用和抗黏附能力；通过Western和免疫荧光，鉴定ZmpB-PepO和PepO-ZmpB的抗原表位以及其与TLR2及TLR4的结合能力。
同时，将ZmpB673-863多肽、ZmpB673-863多肽和Al、ZmpB673-863多肽和PepO的融合蛋白或混合蛋白分别皮下免疫C57BL/6小鼠，于每次免疫前取尾尖血ELISA检测抗体效价，末次免疫七天后取脾细胞检测细胞因子(IL-4,IFN-γ,IL-10和IL-17A)的分泌水平，同时检测血清中特异性抗体效价及亚型，评估疫苗候选蛋白对宿主体液免疫反应和细胞免疫反应的诱导效应。并采用肺炎链球菌19F鼻腔攻毒的方式和D39腹腔攻毒的方式，分别构建定植感染模型和腹腔感染模型，通过观测鼻咽部定植量、肺部炎症反应和生存率，评估疫苗皮下免疫的保护效果。
结果：
成功构建pET-28(a)-ZmpB673-863，经表达纯化后获得重组蛋白ZmpB673-863；Western blot的结果显示，ZmpB673-863抗血清与11种血清型肺炎链球菌均有特异性反应条带。ELISA实验结果显示，与正常血清相比ZmpB673-863抗血清与肺炎链球菌不同血清型中ZmpB蛋白具有较高的结合能力（P＜0.001）。健康成人血清中的抗体效价检测结果显示，ZmpB673-863相较于DnaJ（P＜0.01）和Ply（P＜0.001）具有更高的结合滴度。调理吞噬实验结果显示，加入ZmpB673-863抗血清的小鼠腹腔巨噬细胞对于肺炎链球菌D39、TIGR4以及7F的吞噬，在荧光实验吞噬指数（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.05）和吞噬实验菌载量（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01）上，明显高于PBS组。同时，ZmpB673-863抗血清抑制肺炎链球菌19F和R6对A549细胞的黏附，在荧光实验黏附指数（P＜0.05；P＜0.01）和黏附实验菌载量（P＜0.05；P＜0.05）上，明显低于ZmpB组。
成功构建pET-28(a)-ZmpB-PepO及pET-28(a)-PepO-ZmpB重组质粒，经表达纯化后获得ZmpB-PepO和PepO-ZmpB的重组融合蛋白，且其内毒素含量均不高于0.1EU/μg；Westernblot结果显示：anti-ZmpB及anti-PepO多克隆抗血清可以识别ZmpB-PepO及PepO-ZmpB融合蛋白，同时抗ZmpB-PepO和PepO-ZmpB的抗血清可以特异性的识别重组ZmpB及PepO。免疫荧光的结果显示：ZmpB-PepO及PepO-ZmpB融合蛋白均可通过TLR2和TLR4与巨噬细胞结合，结合能力与单独PepO相比无明显差异（P＞0.05）。
为了评估PepO的佐剂效应，我们使用ZmpB和PepO的联合或融合疫苗免疫小鼠，与用单一蛋白质免疫的小鼠相比，这些小鼠表现出更高的抗ZmpB673-863抗体滴度，出现了更快更强的体液免疫应答。并且在PepO-ZmpB673-863组中，脾细胞分泌的Th细胞相关的细胞因子明显升高。在肺炎链球菌感染模型中，用PepO-ZmpB673-863皮下免疫显著降低鼻咽定植（P＜0.01）和死亡率（P＜0.05），显著低于单独ZmpB673-863组，与ZmpB673-863+Al佐剂组保护效果相当。
结论：
本研究首次证明了ZmpB的N末端的第673至863氨基酸是一种具有潜力的肺炎链球菌疫苗候选多肽，其与PepO的融合蛋白（PepO-ZmpB673-863）皮下免疫小鼠后，能够诱导宿主产生较强的体液免疫和细胞免疫反应，并有效降低肺炎链球菌在小鼠鼻咽部的定植以及致死性感染的生存率，其效应与Al佐剂无显著差异，提示PepO具有佐剂效应，PepO-ZmpB673-863是一种无需额外佐剂的良好疫苗候选蛋白。
肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae，S.pn) 是肺炎、脑膜炎、败血症等严重的侵袭性疾病的致病菌，也是流感继发致死性细菌感染的首要病原菌，可导致耳聋、瘫痪、智力低下等严重的后遗症。然而，目前临床可用的S.pn疫苗对其感染的保护效应并不理想。因此，迫切需要研发新型的S.pn疫苗。
研究显示，S.pn一些保守性好的毒力因子具有作为疫苗的潜能。肺炎链球菌锌金属蛋白酶B（ZmpB）作为一种毒力因子，既往的研究中发现ZmpB亚基是具有潜力的肺炎链球菌候选疫苗，但存在保守型相对较低，或与成人血清型反应较低的问题。我们发现ZmpB的一个新片段，即ZmpB的N末端的第673至863氨基酸（ZmpB673-863），不仅与健康人血清具有高反应性，而且在肺炎链球菌的不同血清型中保守性较高，可能是一种良好的肺炎链球菌疫苗候选蛋白。
佐剂是蛋白疫苗的重要组成部分，目前以TLRs配体为基础的疫苗佐剂是近年来的研究热点。肺炎链球菌内肽酶O（PepO）作为一种新发现的毒力蛋白和TLR2和TLR4的激动剂，具有促炎和增强巨噬细胞吞噬的作用，这提示PepO可能具有佐剂效应。
因此，本研究拟鉴定ZmpB673-863作为肺炎链球菌疫苗候选蛋白的可行性，并以其为疫苗抗原评估PepO的佐剂效应，为构建无需佐剂的新型肺炎链球菌蛋白疫苗提供可靠的实验依据。
方法：
通过原核表达的方式，经Ni2+柱纯化，获得肺炎链球菌ZmpB的N末端的第673至863氨基酸肽段（ZmpB673-863）、PepO蛋白(全长)、和融合蛋白ZmpB673-863-PepO、PepO-ZmpB673-863，进一步去除内毒素，然后皮下免疫C57BL/6小鼠制备相应的多克隆抗血清。通过PCR、Western blot和ELISA验证ZmpB673-863在肺炎链球菌不同血清型的保守性；并建立细胞模型验证ZmpB673-863抗血清的调理吞噬作用和抗黏附能力；通过Western和免疫荧光，鉴定ZmpB-PepO和PepO-ZmpB的抗原表位以及其与TLR2及TLR4的结合能力。
同时，将ZmpB673-863多肽、ZmpB673-863多肽和Al、ZmpB673-863多肽和PepO的融合蛋白或混合蛋白分别皮下免疫C57BL/6小鼠，于每次免疫前取尾尖血ELISA检测抗体效价，末次免疫七天后取脾细胞检测细胞因子(IL-4,IFN-γ,IL-10和IL-17A)的分泌水平，同时检测血清中特异性抗体效价及亚型，评估疫苗候选蛋白对宿主体液免疫反应和细胞免疫反应的诱导效应。并采用肺炎链球菌19F鼻腔攻毒的方式和D39腹腔攻毒的方式，分别构建定植感染模型和腹腔感染模型，通过观测鼻咽部定植量、肺部炎症反应和生存率，评估疫苗皮下免疫的保护效果。
结果：
成功构建pET-28(a)-ZmpB673-863，经表达纯化后获得重组蛋白ZmpB673-863；Western blot的结果显示，ZmpB673-863抗血清与11种血清型肺炎链球菌均有特异性反应条带。ELISA实验结果显示，与正常血清相比ZmpB673-863抗血清与肺炎链球菌不同血清型中ZmpB蛋白具有较高的结合能力（P＜0.001）。健康成人血清中的抗体效价检测结果显示，ZmpB673-863相较于DnaJ（P＜0.01）和Ply（P＜0.001）具有更高的结合滴度。调理吞噬实验结果显示，加入ZmpB673-863抗血清的小鼠腹腔巨噬细胞对于肺炎链球菌D39、TIGR4以及7F的吞噬，在荧光实验吞噬指数（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.05）和吞噬实验菌载量（P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01）上，明显高于PBS组。同时，ZmpB673-863抗血清抑制肺炎链球菌19F和R6对A549细胞的黏附，在荧光实验黏附指数（P＜0.05；P＜0.01）和黏附实验菌载量（P＜0.05；P＜0.05）上，明显低于ZmpB组。
成功构建pET-28(a)-ZmpB-PepO及pET-28(a)-PepO-ZmpB重组质粒，经表达纯化后获得ZmpB-PepO和PepO-ZmpB的重组融合蛋白，且其内毒素含量均不高于0.1EU/μg；Westernblot结果显示：anti-ZmpB及anti-PepO多克隆抗血清可以识别ZmpB-PepO及PepO-ZmpB融合蛋白，同时抗ZmpB-PepO和PepO-ZmpB的抗血清可以特异性的识别重组ZmpB及PepO。免疫荧光的结果显示：ZmpB-PepO及PepO-ZmpB融合蛋白均可通过TLR2和TLR4与巨噬细胞结合，结合能力与单独PepO相比无明显差异（P＞0.05）。
为了评估PepO的佐剂效应，我们使用ZmpB和PepO的联合或融合疫苗免疫小鼠，与用单一蛋白质免疫的小鼠相比，这些小鼠表现出更高的抗ZmpB673-863抗体滴度，出现了更快更强的体液免疫应答。并且在PepO-ZmpB673-863组中，脾细胞分泌的Th细胞相关的细胞因子明显升高。在肺炎链球菌感染模型中，用PepO-ZmpB673-863皮下免疫显著降低鼻咽定植（P＜0.01）和死亡率（P＜0.05），显著低于单独ZmpB673-863组，与ZmpB673-863+Al佐剂组保护效果相当。
结论：
本研究首次证明了ZmpB的N末端的第673至863氨基酸是一种具有潜力的肺炎链球菌疫苗候选多肽，其与PepO的融合蛋白（PepO-ZmpB673-863）皮下免疫小鼠后，能够诱导宿主产生较强的体液免疫和细胞免疫反应，并有效降低肺炎链球菌在小鼠鼻咽部的定植以及致死性感染的生存率，其效应与Al佐剂无显著差异，提示PepO具有佐剂效应，PepO-ZmpB673-863是一种无需额外佐剂的良好疫苗候选蛋白。