背景与目的酗酒后轻微外力引起的致死性外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)时有发生,TSAH常与酗酒有关,国内外学者对此已有共识,但其发生及死亡机制尚未完全清楚。本课题组前期已建立了稳定的大鼠灌酒后TSAH模型,结果显示,慢性灌酒组大鼠TSAH发生率及死亡率分别高达81%和76%,远高于急性灌酒组的27%和4.8%(P<0.01)。综合相关文献及前期实验结果,我们提出长期酗酒对中枢神经系统(central nerves systerm, CNS)代谢、功能和形态各方面的累积性毒理作用,可能构成协同脑震荡性损伤导致TSAH死亡的神经病理学基础的假设。本研究通过观察慢性灌酒中毒的CNS形态学变化,以及与神经纤维轴突运输、信号转导密切相关的Tau蛋白、β-APP表达状况,探讨酗酒与TSAH死亡机制的相关性。材料与方法1动物模型及分组CL级雄性SD大鼠,体重300±30g,常规分笼饲养,随机分:灌水组10只、灌水打击组10只、灌酒组10只、灌酒打击组29只、灌酒停酒组6只。连续灌胃食用水或白酒(52%v/v北京红星二锅头)4周,剂量:前2周8 ml/kg/次、后2周12 ml/kg/次,每天9:00和16:00间隔7小时两次灌胃。2方法灌水组和灌酒组最后一次灌胃2h后,戊巴比妥腹腔注射麻醉后股动脉放血处死;灌水打击和灌酒打击组用自制单摆式打击装置给予脑震荡性打击,同时监测心电15min,存活大鼠打击后观测2h,戊巴比妥腹腔注射麻醉后股动脉放血处死,灌酒打击组中死亡的大鼠归为死亡组,各组均立即剖胸主动脉插管,含钙2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液灌注固定30min,开颅提取全脑,置于4%中性多聚甲醛液固定6h,旁正中矢状切取脑组织,常规石蜡连续切片,分别HE、Bielschowsky’s镀银染色及Tau蛋白、β-APP免疫组织化学染色,光镜观察组织病理形态,图像采集系统观测、采图,Image-Pro Plus 6.0图像分析软件累积积分光密度(IOD sum)等量化病理学测量。同时,备制透射电镜脑组织样本立即置入2.5%戊二醛中,按常规方法清洗、固定、包埋、切片、染色,在JEM-1400透射电子显微镜下观察。3统计分析所有实验数据均采用均数±标准差表示,通过SPSS 17.0及Excel 2003分析处理数据,检验方法采用方差分析(ANOVA)、独立样本T检验、卡方检验。统计学检验所得值差异显著性以P<0.05、P<0.01表示。结果1实验大鼠一般情况观察灌水组饮食、活动状况良好,体重持续增加,第2w始体重增加明显(P<0.01)。灌酒组毛发粗糙、无光泽,精神状况差,并随着灌酒时间延长,逐渐出现体形消瘦、营养不良、进食量、活动减少、肢体瘫软等慢性酒精中毒改变。灌酒组大鼠灌酒后体重逐渐下降,第1w、第3w、第4w体重均明显下降,较灌酒前均差异显著(P<0.01)。灌水打击组心电图呈一过性心率减慢、QRS波群波幅增大,0.3±0.16s后恢复;灌酒打击组大鼠QRS波群波幅明显增大,恢复时间1.7±0.36s,较灌水打击组明显延长(P<0.05);打击死亡组大鼠QRS波幅明显增大,10s-1min后心率进行性减慢后呈直线。灌酒打击组TSAH发生率和死亡率分别为79.3%,51.7%,显著高于灌水打击组(P<0.01,P<0.05),根据Fisher分级法,灌酒打击组大鼠TSAH级别高于灌水打击组。2常规大体和组织病理学观察灌水组神经元、胶质细胞形态和分布正常,神经纤维粗细染色均匀、排列平直紧密。灌水打击组全脑轻度淤血,散在局限性小灶性出血,神经元、胶质细胞轻度水变性,尼氏体浅淡、数目减少,神经纤维不规则扭曲增粗、断裂、周隙扩大,排列疏松。灌酒组全脑表面轻度淤血,神经元排列紊乱,形态不一,散在固缩深染1型变和肿胀淡染2型变神经元,胞体肿大变圆,核增大、偏位,中央性尼氏体溶解、消失;胶质细胞增生;小脑蒲肯野细胞固缩、数目减少、疏密不均;神经纤维排列稍疏松、间隙增大,轻度不规则增粗、变形。灌酒打击组全脑表面弥漫淤血,脑干周围多见厚层TSAH,未见明显脑挫裂伤,神经元及神经胶质细胞高度水变性、周隙扩大,多见核固缩、溶解、消失,中央尼氏体不同程度边集、溶解、消失,多见噬神经及卫星现象;散在神经元脱失,胶质细胞增生;小脑蒲肯野细胞不规则减少,染色、疏密不均、核固缩;延脑多见红色神经元及暗神经元;神经纤维疏松水肿、周隙增宽,可见明显增粗、扭曲、断裂,局部肿胀明显。灌酒停酒组大鼠较灌酒组神经元及神经纤维病变有所缓解。3透射电镜观察灌水组脑干组织致密,神经纤维轴索粗细均匀、形态规整,电子密度较高,髓鞘深色、厚薄均匀,轴膜和髓鞘结合紧密,神经骨架纤维粗细均匀;神经元核、线粒体、高尔基复合体、内质网丰富,大小形态、排列规整,多见核糖体。灌水打击组组织较疏松水肿,电子密度较低,神经纤轴索粗细、深浅不均,髓鞘厚薄不一、散在裂隙分层;神经骨架纤维水肿、排列松散;神经元线粒体疏松肿胀、嵴扩张,内质网轻度扩大,突触间隙增宽、致密斑密度降低。灌酒组脑干组织疏松水肿,神经轴索弥漫粗细、形态不均、排列紊乱,髓鞘不规则分层、厚薄不均,神经纤维轴浆疏密不均,神经骨架纤维粗细不一、部分溶解,髓鞘脂质散在裂隙分层,神经元线粒体明显疏松肿胀、嵴长短粗细不一、外膜不完整,可见胞体、核固缩神经元,核膜皱折、异染色质增多、聚集,核仁固缩;胶质细胞增多,间质疏松水肿。灌酒打击组脑干神经纤维髓鞘高度疏松水肿,可见板层分离、褶叠和内陷,絮状物附着,部分区域形成囊泡样突起突入周围间隙中;神经骨架纤维崩解,局部被絮状沉淀物和膜性结构所代替,周边可见膜性细胞器的积聚,可见空化的线粒体;突触数量减少,突触小泡堆积;胶质细胞增多,间质水肿;在轴膜和髓鞘改变区,轴浆和细胞器逐渐积聚,呈反应性轴突肿胀;神经元体积明显缩小,胞浆及核电子密度增高、核膜皱折,异染色质团块状聚集,核仁消失或变小,核浆比例增大,胞周缝隙增宽,胞膜不完整,线粒体和内质网明显疏松肿胀。灌酒停酒组大鼠较灌酒组神经元及神经纤维病变有所缓解,水肿减轻。4免疫组化观察4.1 Tau蛋白IOD sum值正常组脑组织Tau蛋白主要在神经元的轴突和胞浆阳性表达。灌酒组脑干、小脑、海马、额叶等脑区Tau IOD sum值显著减小(P<0.05)。灌水打击组额叶脑区Tau IOD sum值显著增高(P<0.05),脑干、小脑、海马等部位Tau IOD sum值变化差异不显著(P>0.05)。慢性灌酒打击组脑干、小脑、海马、额叶等部位Tau IOD sum值显著增高(P<0.05)。慢性灌酒打击死亡组脑干、海马、额叶等部位Tau IOD sum值均高于慢性灌酒打击存活组(P<0.05)。4.2β-APP IOD sum值正常组β-APP主要在神经元胞浆阳性表达。灌酒组脑干、小脑、海马等脑区IOD sum值显著增高(P<0.05),额叶变化不显著(P>0.05)。灌水打击组脑干、海马等脑区β-APP IODsum值显著增高(P<0.05),小脑、额叶等部位差异不显著(P>0.05)。慢性灌酒打击组脑干、小脑、海马、额叶等部位β-APP IOD sum值显著减小(P<0.05)。慢性灌酒打击死亡组小脑、海马等部位β-APP IOD sum值均显著高于慢性灌酒打击存活组(P<0.05)。结论1、慢性酒精中毒可引起CNS神经纤维细胞骨架的形态结构破坏,降低传导功能的代偿性,导致易损性增加,提示其可能为慢性酗酒后,在脑震荡性打击下高死亡率发生的病理形态基础。2、大鼠脑干、小脑、海马、额叶等脑区Tau蛋白、β-APP的表达和分布显示,慢性酒精中毒显著降低CNS骨架蛋白Tau表达、上调CNSβ-APP的表达,分析认为上述变化可能是长期慢性酗酒脑白质萎缩、神经突起数量减少的机制之一,参与了慢性酒精中毒TSAH死亡的病理代谢基础。3、结合本课题组前期工作结果,认为酗酒相关的TSAH中,慢性酒精累积性CNS毒理学效应构成了神经损伤的重要病理学基础,可能是协同轻微的脑震荡性打击促进死亡的机制之一。