【摘 要】
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目的:1.探明M2a巨噬细胞标记物（CD206）阳性细胞在人体和大鼠退变椎间盘组织中的表达;2.探究M2a巨噬细胞通过分泌几丁质酶3样蛋白1（chitinase 3-like protein 1,CHI3L1）对椎间盘细胞外基质（extracellular matrix,ECM）代谢的影响;3.阐明CHI3L1通过IL13Rα2/MAPK通路调节椎间盘ECM代谢的机制。方法:1.手术收集人体退变椎
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目的:1.探明M2a巨噬细胞标记物（CD206）阳性细胞在人体和大鼠退变椎间盘组织中的表达;2.探究M2a巨噬细胞通过分泌几丁质酶3样蛋白1（chitinase 3-like protein 1,CHI3L1）对椎间盘细胞外基质（extracellular matrix,ECM）代谢的影响;3.阐明CHI3L1通过IL13Rα2/MAPK通路调节椎间盘ECM代谢的机制。方法:1.手术收集人体退变椎间盘组织;通过针刺尾椎制作大鼠椎间盘退变模型,磁共振成像（MRI）验证模型;通过免疫组化探究CD206阳性细胞在人体和大鼠髓核组织的表达。IL-1β联合TNFα模拟椎间盘退变炎症微环境干预髓核细胞,通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）、蛋白印迹法（Western blot）、免疫荧光检测髓核细胞对M2a巨噬细胞相关标记物基因（CCL18、CCL22、CD206）的表达。2.通过佛波酯（PMA）和白细胞介素-4（IL-4）刺激人单核细胞THP-1产生M2a巨噬细胞极化;通过Transwell装置建立M2a巨噬细胞与髓核细胞体外共培养,通过Western blot、q RT-PCR检测其对髓核细胞ECM代谢相关基因表达的影响。通过Western blot检测M2a巨噬细胞CHI3L1的分泌特性;通过si RNA沉默M2a巨噬细胞CHI3L1基因,探究M2a巨噬细胞是否通过CHI3L1介导其生物学效应。3.为进一步阐明CHI3L1作用机制,使用CHI3L1重组蛋白（r CHI3L1）干预髓核细胞,通过免疫荧光双染检测CHI3L1及其潜在受体IL-13Rα2在髓核细胞的共定位;通过si RNA沉默髓核细胞IL-13Rα2受体,检测该受体在髓核细胞中的作用。通过Western blot检测这一过程中MAPK信号通路变化,并通过MAPK通路小分子抑制剂（U0126、SP600125）进一步验证MAPK通路在CHI3L1促进髓核细胞ECM代谢失衡中的作用。结果:1.MRI验证大鼠椎间盘退变模型成功构建;人和大鼠退变椎间盘组织均存在CD206阳性细胞表达;大鼠退变椎间盘组织中CD206阳性细胞广泛存在,且与髓核细胞形态相似。IL-1β联合TNFα模拟炎症微环境刺激,可诱导大鼠髓核细胞表达M2a巨噬细胞标记物相关基因（CCL18、CCL22、CD206）。2.M2a巨噬细胞与髓核细胞共培养条件下,可促进髓核细胞ECM分解代谢相关基因（MMP-3和MMP-9）的表达,抑制其合成代谢相关基因（Aggrecan和CollagenⅡ）的表达。M2a巨噬细胞可特异性分泌CHI3L1蛋白,si RNA沉默M2a巨噬细胞CHI3L1后可部分抑制其对髓核细胞的效应。3.免疫荧光双染检测显示CHI3L1及其潜在受体IL-13Rα2在髓核细胞存在共定位,si RNA沉默髓核细胞IL-13Rα2受体可抑制r CHI3L1对髓核细胞的效应。r CHI3L1干预髓核细胞后,ERK和JNK磷酸化水平升高,小分子抑制剂U0126或SP600125分别阻断ERK和JNK后可抑制r CHI3L1对髓核细胞的效应。结论:1.人和大鼠退变椎间盘组织均存在CD206阳性细胞表达;大鼠髓核细胞在炎症环境刺激后可表达M2a巨噬细胞标记物相关基因;退变椎间盘内部分巨噬细胞标记物阳性细胞可能来源于髓核细胞。2.M2a巨噬细胞可促进髓核细胞ECM代谢失衡,这种作用可能部分由M2a巨噬细胞分泌的CHI3L1蛋白介导。3.CHI3L1可能通过IL-13Rα2/MAPK信号通路调控髓核细胞的ECM代谢,且主要通过ERK和JNK通路在髓核细胞发挥作用。
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