玉米是重要的粮食与饲料作物,在保证国家粮食安全中发挥了重要作用。杂交种子的生产是保证玉米高产稳产的关键,而细胞质雄性不育系的利用是简化种子生产程序,降低生产成本的一条有效途径,而明确玉米细胞质雄性不育的恢复机理可以为不育化制种技术的应用提供重要的理论与技术支撑。倒伏是影响玉米产量的一个重要因素,而由穗下节间过长引起的穗位过高是引起倒伏的一个重要原因。本课题组在前期研究的基础上,对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4的遗传机理进行了研究,并对玉米穗下节间长相关的miRNA及其靶基因进行了分析。主要研究结论如下:1.利用全基因组关联分析对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4进行了定位,在第8染色体的短臂上检测到9个显著关联的SNP位点,均位于一个编码转录因子transcpt_factor_SBP_box的基因内,该基因含有SBP结构域和ANK结构域,结合前期精细定位的结果将其确定为恢复基因Rf4的候选基因。2.根据B73的序列,发现候选基因有3个不同的转录本。对不同的转录本进行验证后发现Rf4-T1包含1个外显子,Rf4-T2不存在,而Rf4-T01包含有11个外显子。结合前期研究结果,说明这个转录本不是恢复基因Rf4。3.利用RACE技术获得Rf4-T01转录本的cDNA全长,序列分析结果表明,不育系和恢复系四分体时期扩增片段都比Rf4-T01短,而且不育系中扩增片段r-RACE有1条,长2043bp;而恢复系中扩增片段有两条,分别是R-RACE-1长1942bp,R-RACE-2长1794bp。经ORF预测发现r-RACE 的 ORF(1545bp)与 R-RACE-2 的 ORF 长度一致,都是 1548bp,都比 R-RACE-2 的 ORF(996bp)多出549bp。说明不育系和恢复系中存在Rf4-T01以外的新转录本。结构域预测发现Rf4-T01有两个结构域,分别是SBP结构域和ANK结构域,而r-RACE、R-RACE-1和R-RACE-2的ORF都只含有一个ANK结构域。4.qRT-PCR分析结果表明,R-RACE-2在87-1三系不同时期表现为组成型表达,但是在不同材料相同时期或者同种材料不同时期表达有差异,其中在不育系的小穗和小花期表达量最高,而在恢复系四分体时期的表达量比其它两个材料四分体时期的表达量高2倍以上,在恢复系单核期的表达量也明显高于其它两个材料对应的时期。说明与不育系相比,恢复基因在四分体时期和单核期是上调表达。5.主要针对两个结构域和Rf4-T01的5’端设计了多抗抗体,分别选87-1不育系CMS-C(rf4rf4rf5rf5)、87-1恢复系CMS-C(Rf4Rf4rf5rf5)、87-1保持系N(rf4rf4rf5rf5)以及单基因Rf5恢复系6233 CMS-C(rf4rf4Rf5Rf5)和CMS-C(Rf4rf4Rf5rf5)的四分体前期、四分体和单核期样品进行Western blot。针对Rf4-T01 5’端设计的多抗抗体,根据对Western blot杂交条带的大小和强弱分析,说明Rf4-T01这个转录本可能不翻译,也不是恢复基因Rf4。对于SBP结构域的多抗抗体,根据对杂交条带的大小,有无和强弱分析,说明含有SBP结构域的转录本有两个,但由于70KD和90KD的杂交带强弱在不同材料不同时期差异不明显,所以编码这两个蛋白的转录本都不是恢复基因Rf4。而对于ANK结构域的多抗抗体,结合RACE获得的结果,说明R-RACE-2是恢复基因Rf4编码蛋白的序列,而且从杂交带强弱可以看出该转录本编码的蛋白在四分体时期和单核期对rf4rf4基因的表达具有掩盖作用。6.选用我国生产上的玉米骨干自交系浚928和浚9058(浚单20的亲本)的穗下第7、第8、第9节间作为研究材料,对其分别进行了 miRNA测序和降解组分析。在自交系浚9058的3个节间材料中共检测出45个两个节间之间表达量差异显著的miRNA;同样在自交系浚928中共检测出54个差异表达的miRNA,在两个自交系中共检测出31个差异显著表达的共同miRNA。根据降解组测序的数据,对属于zma-miR160,zma-miR167、zma-miR164、zma-miR169和zma-miR393 家族的20个miRNA进行了分析。通过降解组测序结果发现其靶基因分别编码生长素应答因子、NAC蛋白、NFY核转录因子和生长素信号分子AFB2。结合前人研究结果,发现差异表达miRNA的靶基因主要在ABA和IAA信号应答中起重要作用,通过应答激素信号调控调节玉米穗下节间生长和发育。