目的:临床搜集先天缺牙病例,对已确诊为重度牙齿先天缺失的患者进行全外显子测序及突变基因致病性预测,筛选出可能有害的突变并进行Sanger测序验证。综合以上结果,对基因型-表型相关性进行遗传学分析。方法:1.患者临床资料采集本课题经天津医科大学口腔医院伦理委员会批准,所有操作符合要求。向患者(患儿家长)介绍实验目的、个人隐私保密性等情况后签知情同意书。选择门诊中疑似先天缺牙患者,拍摄全口曲面断层片明确诊断。详细询问病史,排除因外伤、牙周病、正畸治疗、牙髓病和根尖周病等拔除患牙或伴有全身疾病的病例。询问先天缺牙患者家族史,了解其家系中先天缺牙患病情况。本研究纳入先证者及其表型正常的父母,绘制家系图,采取静脉外周血保存在-80℃冰箱待用。2.全外显子测序及初步筛选相关突变位点首先进行血样DNA质量检测,对符合测序标准的样本(DNA含量>0.6μg)采用Agilent系统进行全外显子区域DNA高效富集并进行库检。库检合格的DNA在Illumina平台上进行高通量、高深度测序。实验操作严格按照最新、最优化的标准进行。去除频率高于1%多态性位点及同义SNP,保留位于外显子及影响剪接的SNP、In Del。保守域的突变可能对蛋白质功能影响较大,利用gerp++gt2预测突变位点的保守性。应用Dbsc SNV预测突变位点是否影响剪接。利用SIFT,Polyphen-2,Mutation Taster及CADD软件对候选突变位点进行有害性分析。利用Phenolyzer软件对基因型-牙齿先天缺失表型相关性进行排名,选取前15名与重度缺牙表型相关的候选基因进行分析。综上,对于被预测有害、位于保守域及影响剪接的先天缺牙相关突变位点进行Sanger测序验证。3.Sanger测序利用Prime 5软件设计的突变基因正反向引物进行测序。4.目标位点突变碱基等位基因频率分析IGV作为分析BAM数据的有效工具,生成的序列比对图可以直观、定量的显示目标等位基因相应碱基频率的变化。5.蛋白质二级结构预测应用Protean软件预测突变蛋白二级结构并与正常蛋白进行比对,分析突变蛋白对重度缺牙表型的有害性。结果:1.纳入该家系的3个成员,仅先证者发病,父母均正常。基因型-表型相关性排名中,MSX1基因分值为1,与先证者先天缺牙关联最为密切。先证者和母亲在MSX1上携带两个突变。一个是位于exon2上未报道过的错义突变(c.C667G,p.R223G),另外一个是位于exon1上的同义突变(c.C348T,p.G116G,rs34165410)。2.通过Sanger测序验证了位于先证者和母亲MSX1基因上的两个突变,同时发现母亲exon2的错义突变(c.C667G,p.R223G)波峰明显低平,考虑MSX1 c.C667G嵌合突变的可能性。重复Sanger测序验证了母亲存在嵌合现象。3.IGV分析结果显示母亲MSX1 c.C667G位点上G碱基比例为14%,与Sanger测序结果一致。4.Protean预测结果显示MSX1突变蛋白第223号氨基酸附近α螺旋明显截短。结论:1.MSX1上的错义突变(c.C667G,p.R223G)位于高度保守区,可能是先证者先天缺牙的主要原因。2.母体存在的MSX1 c.C667G嵌合突变解释了母亲未发生先天缺牙的可能原因。该嵌合突变可能通过生殖细胞遗传给先证者并导致重度先天缺牙。3.研究结果提示,在临床工作中对于怀疑发生新生突变的患者,应详细询问家族史,考虑该突变是否源于母/父嵌合体;对无表型的嵌合突变携带者而言,其后代有患病的风险。