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目的:凋亡反应是心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的关键环节,抑制心肌细胞凋亡可有效减轻MI/RI,本实验拟通过mi R-327重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞与大鼠心肌组织,研究mi R-327对MI/RI诱导的心肌细胞凋亡的作用,并进一步探讨其通过调控凋亡抑制因子(ARC)等相关信号通路对MI/RI的影响,为防治MI/RI提供理论依据和新的治疗靶点。方法:(1)细胞实验:培养H9C2大鼠心肌细胞,随机分成5组:空白对照组(control组),缺氧复氧组(H/R组)、腺病毒空载组(Ad-EGFP-NC+H/R,Ad-NC组)、mi R-327上调组(Ad-mi R-327+H/R,Ad-mi R-327组)、mi R-327下调组(Ad-mi R-327-RNAi+H/R,Ad-mi R-327i组)。将重组腺病毒载体转染H9C2心肌细胞48 h后,建立心肌缺氧复氧(H/R)损伤模型(缺氧4 h,复氧12 h)。采用荧光显微镜和流式细胞仪测定腺病毒转染效率;CCK-8法检测细胞存活率;全自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放水平;流式细胞仪检测凋亡率;实时荧光定量PCR(q PCR)法测定mi R-327与ARC的m RNA含量;Western blot法检测ARC、内源性以及外源性凋亡级联反应cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Caspase-8、Cyt-c、Bax、Bcl-2、Fas以及Fas L蛋白表达水平;双荧光素报告基因检测验证mi R-327与ARC的靶向作用关系。(2)动物实验:将70只雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、腺病毒空载组(Ad-EGFP-NC+I/R,Ad-NC组)、mi R-327上调组(Ad-mi R-327+I/R,Ad-mi R-327组)、mi R-327下调组(Ad-mi R-327-RNAi+I/R,Ad-mi R-327i组)。病毒液或等量生理盐水心肌多点注射72 h后,冠状动脉左前降支缺血30 min再灌注3 h构建MI/RI模型。荧光显微镜观察心肌组织腺病毒转染情况;TTC染色法检测各组大鼠心肌梗死面积比;TUNEL染色检测各组心肌组织凋亡指数;血清检测LDH含量;q PCR法测定mi R-327与ARC的m RNA含量;Western blot法检测心肌组织ARC、内源性以及外源性凋亡级联反应cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Caspase-8、Cyt-c、Bax、Bcl-2、Fas以及Fas L蛋白表达水平。结果:1.细胞实验:(1)H/R刺激后H9C2细胞中mi R-327和ARC表达变化:与Control组相比,H/R组心肌细胞中mi R-327表达显著上升,ARC表达显著下降(P<0.05)。(2)腺病毒成功转染至H9C2细胞:转染48 h后,荧光显微镜下可见明显的绿色荧光蛋白,并确定MOI=50为最佳感染复数。(3)mi R-327下调抑制H/R诱导的心肌细胞损伤及凋亡反应:与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组mi R-327表达明显降低,心肌细胞存活率显著上升,凋亡率、LDH释放以及cleaved Caspase-3表达明显减少;Ad-mi R-327组mi R-327表达明显上升,心肌细胞存活率显著降低,凋亡率、LDH释放以及cleaved Caspase-3表达增加(以上P<0.05)。(4)mi R-327下调可抑制H/R诱导的心肌细胞凋亡级联反应:与Control组相比,H/R组内源性与外源性凋亡级联反应中促凋亡分子cleaved Caspase-9、Caspase-8、Cyt-c、Bax、Fas、Fas L表达均明显增加,抗凋亡分子Bcl-2表达明显减少;与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组内源性与外源性凋亡级联反应中促凋亡分子表达明显减少,抗凋亡分子表达明显增加;而Ad-mi R-327组中上述分子表达呈相反效应(以上P<0.05)。(5)mi R-327靶向调控ARC表达:与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组ARC蛋白水平显著升高,Ad-mi R-327组ARC蛋白水平显著下降,而ARC的m RNA表达水平未见明显变化;双荧光素酶报告基因结果显示,mi R-327与ARC3′UTR存在特异性结合(以上P<0.05)。2.动物实验:(1)成功建立大鼠MI/RI模型:与sham组相比,I/R组mi R-327表达明显上升,ARC表达明显下降(P<0.05)。(2)腺病毒成功转染大鼠心肌组织:转染72 h后,荧光显微镜下可见Ad-NC组,Ad-mi R-327组和Ad-mi R-327i组均存在明显的GFP表达。(3)mi R-327调控MI/RI后心肌组织中ARC的表达:与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组中mi R-327表达显著减少且ARC的蛋白表达明显增加,而Ad-mi R-327组中mi R-327表达显著增加且ARC的蛋白表达显著减少(P<0.05),ARC的m RNA表达水平未见明显变化。(4)mi R-327下调可减轻MI/RI诱导的心肌损伤及凋亡反应:与Ad-NC组相比,Ad-mi R-327i组心肌梗死面积,心肌凋亡指数以及血清LDH含量均显著降低,而Ad-mi R-327组心肌梗死面积和心肌凋亡指数以及血清LDH表达明显增加(以上P<0.05)。(5)mi R-327下调可通过调控ARC表达来抑制MI/RI诱导的凋亡级联反应:与Ad-NC组相比,下调mi R-327的表达,可明显减少内源性与外源性凋亡级联反应中促凋亡分子表达,并增加抗凋亡蛋白表达;而上调mi R-327的表达可发挥相反的效应(以上P<0.05)。结论:下调mi R-327可在转录后水平负性调控ARC的表达,从而减少内源性及外源性凋亡级联反应,有效改善MI/RI诱导的心肌损伤,减少心肌细胞凋亡。