【摘 要】
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禽白血病（Avian leukosis,AL）是一类由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起发病鸡生产性能下降、发生肿瘤和死亡的禽类传染性疾病。目前发现感染鸡群的ALV可分为A、B、C、D、E、J和K等,其中J亚群（Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J）为我国主要流行亚群。ALV-J致病性高,常伴有多重感染和继发感染,直接影响生产
【基金项目】
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广东省家禽产业技术体系疾病控制岗位专家（2018LM1114,2019KJ128）； 国家肉鸡产业技术体系岗位科学家（CARS-41-G16）；
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禽白血病（Avian leukosis,AL）是一类由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起发病鸡生产性能下降、发生肿瘤和死亡的禽类传染性疾病。目前发现感染鸡群的ALV可分为A、B、C、D、E、J和K等,其中J亚群（Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J）为我国主要流行亚群。ALV-J致病性高,常伴有多重感染和继发感染,直接影响生产性能,给养禽业造成巨大损失。家禽肠道易受病原微生物的影响,可导致生产性能下降甚至死亡,而肠上皮细胞可形成屏障抵御病原微生物侵入机体。为了解ALV-J感染对鸡肠道的影响,本研究拟在体外探析ALV-J感染鸡胚肠上皮细胞（Intestinal epithelial cells,IECs）对其结构与功能的影响。本研究通过对18～19日龄的SPF（Specific-pathogen-free）鸡胚十二指肠进行IECs分离培养,通过观察细胞形态、PCR检测特异性基因角蛋白19（Cytokeratin 19,CK19）、碱性磷酸酶染色、抗E-钙粘蛋白免疫荧光染色等进行鉴定,用CCK-8试剂检测分离所得IECs的活性。结果显示,分离到含隐窝细胞团的细胞悬液在培养1 d后长成单层多角形细胞,PCR检测到约144 bp CK19特异性条带,碱性磷酸酶染色后细胞内含棕黑色颗粒,抗E-钙粘蛋白免疫荧光染色后的细胞呈“铺路石”样网状排列且产生特异性绿色荧光,CCK-8细胞活性检测表明IECs发生显著增殖（p＜0.05）,表明成功分离到具有良好细胞活性的IECs。将ALV-J HN06分离株以0.01 MOI感染培养1 d后的IECs,对ALV-J受体基因（ch NHE1）关键区域进行PCR扩增,以感染后1～5 d IECs c DNA为模板进行PCR和荧光定量PCR检测ALV-J,感染3 d后IECs经p27抗原ELISA检测为阳性后,分别利用ALV p27和JE9单克隆抗体进行间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验。结果显示,PCR可扩增到约153 bp的特异性条带、经测序验证为ALV-J细胞受体ch NHE1的关键区域序列,从感染ALV-J的IECs c DNA中PCR检测到约545 bp ALV-J特异性条带,且经荧光定量PCR检测ALV-J为阳性,间接免疫荧光试验中仅感染后的IECs有特异性绿色荧光,蛋白免疫印迹试验中仅感染后IECs有ALV p27蛋白条带。上述研究表明ALV-J可感染IECs,并进行有效复制。为探析ALV-J感染对IECs结构和功能的影响,将ALV-J HN06分离株以0.01 MOI感染培养1 d后的IECs,通过CCK-8试剂检测细胞活性变化,结合流式细胞仪通过Annexin V-FITC和TUNEL细胞凋亡检测试剂盒染色,并通过荧光定量PCR检测Caspase3和Caspase9 m RNA表达水平分析细胞凋亡变化,通过荧光定量PCR检测IECs紧密连接蛋白（Zo-1、Occludin）、Toll样基因（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR15、TLR21）及细胞因子（IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-6、IL-8）m RNA表达水平变化。结果显示,相较于对照组,ALV-J感染后IECs细胞活性显著降低（p＜0.05）,Annexin V-FITC染色后可见有细胞发出绿色特异性荧光,TUNEL染色后可见有细胞发出红色特异性荧光,流式分析感染ALV-J IECs凋亡率增加,Caspase3和Caspase9的表达水平增加,且Caspase9在感染后第2、4、5 d显著增加（p＜0.05）;Occludin和Zo-1的m RNA表达水平仅在感染后第4 d显著增加（p＜0.05）;在感染后第2～5 d,TLR1、TLR2、TLR5、TLR15和TLR21表达水平显著增加（p＜0.05）,TLR7仅在感染后第1 d显著降低（p＜0.05）,TLR4在感染后第1 d和第5 d显著降低（p＜0.05）;同时,IFN-α和IL-6表达水平变化不明显,但IFN-β在第4 d显著增加（p＜0.05）,IL-2和IL-8在感染后第2 d分别呈显著（p＜0.05）和极显著（p＜0.001）增加。综上所述,本文在分离培养IECs的基础上,建立了IECs体外感染ALV-J模型。ALV-J感染促进IECs发生细胞凋亡,细胞活性降低,导致IECs的结构完整性破坏,刺激IECs产生抗病毒因子和炎症细胞因子,促进Toll样受体基因的差异表达。本研究结果为进一步探究ALV-J感染对肠道健康影响提供数据支持,将有助于全面研究ALV-J的致病机制。
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