近年来,农药和抗生素的大量使用导致水生生态系统破坏日趋严重。由于不同污染源可以引起复合污染,因此农药和抗生素的联合暴露所导致的生态问题引起了广泛关注。农药氯氰菊酯（cypermethrin,CMN）和抗生素磺胺甲恶唑（sulfamethoxazole,SMZ）是水生态系统中两种常见的污染物,然而,它们对鱼类的毒性机制尚未得到充分研究。作为中国主要的淡水经济鱼类,草鱼比其他鲤科鱼更容易受到病源的影响。目前,草鱼已成为环境科学研究中一种敏感而有效的指示生物。本研究以草鱼为模式生物,通过动物和细胞实验,探讨CMN、SMZ单独及联合暴露对草鱼的毒性损伤效应以及作用机理。一、动物实验:以草鱼为实验对象,选用环境相关浓度的CMN（0.651μg/L）和SMZ（0.3μg/L）为目标化合物,探究单独和联合暴露后对草鱼生理功能的影响。动物实验分为两部分:第一部分为CMN和SMZ单独或联合（MIX）暴露的亚慢性毒理实验。采用病理学观察、生化实验、肠道微生物测序、转录组学和代谢组学测序等方法,研究污染物暴露对草鱼造成的神经毒性、免疫毒性以及肝脏代谢毒性。结果显示:在草鱼脑、肝脏、肠道以及脾脏组织中,H＆E染色表明CMN、SMZ和MIX组出现炎性细胞浸润、核溶解、固缩和异位以及空泡化等病理特征;透射电镜结果表明,各暴露组的细胞表现出内质网肿胀、线粒体肿胀和空泡化、核固缩等异常现象。CMN和SMZ暴露可导致肝脏、肠道和脾脏中抗氧化指标CAT、SOD以及GSH水平的降低,伴随着MDA水平的升高（p＜0.05或p＜0.01）;在脑组织中SOD的活性以及MDA和8-OHd G的含量显著升高（p＜0.05或p＜0.01）。TUNEL染色表明,CMN和SMZ均可显著诱导脑、脾脏以及肝脏组织发生凋亡（p＜0.01）。草鱼血清生化指标显示,各处理组中C3、Ig M和CRP的含量以及溶菌酶（LYS）活性均降低（p＜0.05或p＜0.01）,而肝功指标（AST和ALT活性）较对照组显著升高（p＜0.01）。另外,血脑屏障以及肠屏障相关的紧密连接蛋白,如Occludin、Claudins、ZO-1和ZO-2等,水平均显著降低（p＜0.05或p＜0.01）。脾脏和肠道的白介素（IL-1β、IL-6、IL-8）以及TNF-α水平显著升高（p＜0.05或p＜0.01）。并且与CMN和SMZ单独暴露导致的脑、肝脏、肠道以及脾脏毒性相比,在联合暴露组中观察到更显著的变化。基于肠道微生物组学分析我们发现,CMN和SMZ单独和联合暴露后,变形菌门（Proteobacteria）成为较为优势的菌群。我们通过LC/MS非靶向代谢组学测序寻求CMN和SMZ导致肝毒性的异同。分析结果显示,与CMN（45个）和SMZ（32个）相比,MIX组（97个）表现出更多的差异代谢产物,且主要富集在甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢途径。第二部分为嗜水气单胞菌攻毒实验。嗜水气单胞菌会引起草鱼肠道出现感染性出血,威胁着草鱼养殖业的发展。当暴露实验结束后,我们对剩余草鱼进行嗜水气单胞菌注射。结果表明:细菌攻击后,与对照组相比,CMN、SMZ和MIX组草鱼死亡率显著增加（p＜0.01）,Toll样受体（TLR）通路相关免疫因子的表达（如TLR2、TLR4、MYD88、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8）显著降低（p＜0.01）,且MIX组变化最为显著（p＜0.05或p＜0.01）。结果表明,CMN和SMZ暴露后最终会破坏草鱼免疫识别系统和清除病原体的能力,使其更易受到病原菌感染而致死。因此,降低环境污染物暴露,对草鱼养殖过程中疾病的预防和控制具有重要意义。二、细胞实验:基于转录组学测序结果,使用KEGG数据库进行富集分析。结果显示,CMN、SMZ以及联合暴露条件下,差异基因分别富集在蛋白酶体和氧化磷酸化信号通路、药物代谢-细胞色素P450途径以及过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路。使用L8824细胞系（草鱼肝细胞系）为模型,进行CMN和SMZ毒性机制探究。细胞实验分为三部分:第一部分探讨蛋白酶体途径在CMN致L8824细胞毒性中的作用。结果表明:CMN暴露后,L8824细胞活性氧水平、细胞凋亡率和8-OHd G、MDA的累积均显著升高（p＜0.05或p＜0.01）。CMN显著抑制Nrf2的核积累以及下游抗氧化基因HO-1、NQO1、SOD1、SOD2和CAT的转录水平（p＜0.01）,并伴随着抗氧化系统的总体抑制。CMN显著促进NF-κB的核积累以及下游促炎基因IL-1β、IL-8、IL-12p40、IFN-γ2和TNF-α的转录水平（p＜0.01）。与CMN组相比,蛋白酶体特异性抑制剂MG132共处理增加了Nrf2的核易位,激活其下游抗氧化基因的转录和SOD、CAT、GR、GST等抗氧化物水平（p＜0.05或p＜0.01）;降低NF-κB的核易位,缓解炎症因子的分泌。因此,Nrf2和NF-κB之间的串扰可能参与外源性肝毒性的新机制。第二部分探讨细胞色素P450代谢途径在SMZ致L8824细胞毒性中的作用。结果表明:浓度和时间进程分析显示,SMZ分别在10μM作用2h时和30μM作用48h时,CYP1A表现出最大程度的升高和降低（p＜0.01）。于是我们分别使用si RNA敲低和pc DNA3.1过表达方法恢复了CYP1A水平,缓解了SMZ诱导的ROS生成,抗氧化系统失衡,以及凋亡率的升高（p＜0.01）。同时,Nrf2和内质网应激通路参与SMZ诱导的肝细胞代谢防御反应。本研究显示,CYP1A可作为缓解SMZ致肝毒性的潜在靶标分子。第三部分探讨脂质代谢信号通路（PPAR）在CMN和SMZ联合暴露致L8824细胞毒性中的作用。结果表明:CMN和SMZ暴露显著诱导PPARα和FATP1表达以及ROS生成（p＜0.05或p＜0.01）,抑制ACSL1和CPT-1的m RNA表达水平（p＜0.01）。与CMN和SMZ组相比,MIX组上述变化更为显著（p＜0.05或p＜0.01）。因此,CMN和SMZ联合暴露后,可显著激活脂质代谢,主要涉及PPAR信号通路,脂肪酸合成,脂肪因子信号通路等,导致代谢系统发生紊乱,从而影响鱼类营养的有效摄入与利用。综上所述,本研究从体内实验阐明CMN和SMZ暴露可导致草鱼神经毒性、免疫毒性以及肝脏代谢毒性,并降低草鱼免疫系统识别和清除病原体的能力;并从细胞水平探究CMN和SMZ单独或联合暴露对L8824毒性的异同。本研究为农药和抗生素的安全评价及风险评估提供基础数据,相关指标可作为生物标志物,可有效预测环境污染物对生物体和生态系统的潜在威胁。