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研究背景 自杀基因疗法是利用基因工程技术将一些病毒或细菌等原核生物含有而哺乳动物细胞中不含有或表达水平极低的前药转换酶基因导入肿瘤细胞进行表达，其产物（前药转换酶）使无毒性的前药变成细胞毒物质，从而达到杀伤肿瘤细胞作用。该疗法通过直接杀伤效应和旁观者效应杀伤肿瘤细胞，而对正常机体细胞损伤轻微，因此能够在获得良好肿瘤治疗效果的同时明显降低全身毒副反应，目前已成为肿瘤基因治疗研究的前沿课题。 迄今研究最为深入的两大自杀基因系统是HSV-TK／GCV和CD／5-FC。美国FDA已经批准多项有关HSV-TK／GCV和CD／5—FC的临床治疗实验方案。鉴于不同类型肿瘤细胞对自杀基因系统的敏感性不同、单一自杀基因系统治疗时部分肿瘤细胞易产生耐药以及CD／5-FC和HSV-TK／GCV系统的作用机理具有很强的互补性，联合应用CD／5-FC和HSV-TK／GCV两系统不仅可以提高肿瘤细胞杀伤作用，改善治疗效果，而且可以扩大肿瘤治疗谱，减少耐药现象发生。 自杀基因疗法要求自杀基因能在肿瘤细胞特异性表达而不在正常细胞中表达，一个能达到这一目的的方法是利用肿瘤组织特异性调控元件（启动子或增强子）调控自杀基因表达，如甲胎蛋白基因启动子用于肝癌自杀基因疗法、erbB2启动子用于乳腺癌自杀基因疗法等。但是这些启动子仅针对某一类型肿瘤，应用具有一定局限性。血管内皮细胞生长因子（VEGF）几乎在所有实体瘤细胞中都有过量表达，而正常组织中不表达或表达甚微，以VEGF启动子驱动自杀基因，可使自杀基因在肿瘤细胞特异性表达，达到靶向治疗作用，而且几乎可以应用于所有实体瘤。 自杀基因疗法大多以病毒作为载体。最常用的自杀基因病毒载体有腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒等。腺相关病毒载体容量小，插入的外源基因小于4.7kb而且病毒滴度低（＜104／ml）；单纯疱疹病毒容易引起急性细胞损害且可转变成野生型，具有嗜神经性，主要用于神经系统疾病；逆转录病毒的外源基因能随机整合入宿主细胞，因此具有致癌性，另外它只感染分裂期细胞而且病毒滴度低（仅106～108／ml）。而腺病毒作为载体具有以下优点：1)病毒滴度高(1010～1012／ml)；2)感染范围广，不但可感染分裂期细胞，而且可感染静息期细胞；3)感染细胞时其DNA不整合到宿主染色体中，没有潜在的致癌危险;4)可插入7一skb的外源DNA片段;5)可用于体内基因直接转移等生物学特点，因此腺病毒被广泛应用于各种基因治疗，特别是肿瘤自杀基因治疗。在细菌内同源重组法发现以前，制备重组腺病毒仅在少数实验室能完成。随着分子生物学和基因工程技术的发展，腺病毒的制备已经相对简化，特别是在应用AdEasier一1系统以后，重组腺病毒的制备可以在一般实验室开展，因此腺病毒载体的应用日益广泛，目前已成为自杀基因疗法的首选载体。基于以上研究，本课题拟构建腺病毒介导的VEGF启动子一CD/TK融合基因系统，并观察该重组腺病毒对LOVO细胞的体外杀伤作用，为进一步开展腺病毒介导CD/TK融合基因靶向治疗大肠癌的研究提供实验依据。目的一、应用AdEasie卜1系统制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因的重组腺病毒质粒，经293细胞包装、扩增获取重组腺病毒。行氯化艳密度梯度离心纯化，并行PCR鉴定。二、应用含vEGF启动子驱动的CD/TK融合基因的重组腺病毒感染LOVO细胞，在前药5一氟胞喀睫（5一FC）和/或更昔洛韦（GCV）作用下，测定肿瘤细胞的细胞克隆形成率和细胞存活率以观察腺病毒介导的CD/5一FC和HSV一T幻GCV系统对大肠癌细胞的体外杀伤效应。方法一、构建转移质粒pAdtrae卜vEGFP一englyTK 首先，用Notl和众01切下pEGFP一l一sv-vEGFP上的vEoFP，亚克隆至pAdtrack构建pAdtrack一vEGFP。再分别以JM 109细菌和pREPS一TK为模板，PCR扩增出CD和TK基因片段，亚克隆到中间载体penNA3构建含CDglyTK融合基因的peDNA3一CDglyTK。用Hl’nd 111和尸vull酶切，回收纯化一大小约2.6比、含polyA尾的片段eDglyTK一pA，插入到穿梭质粒pAdtrack一vEGFP上构建转移质粒pAdtrack一vEGFP一CDglyTK，行酶切鉴定。二、构建重组腺病毒质粒pAdEasy.VEGFP一CDglyTK 用Pmol酶切线性化pAd脉k一vEGFP一cDgiyTK，转化用氯化钙法制备的AdEasier-1感受态细菌，使pAdtrack一vEGFP一cDgiyTK和腺病毒基因组PAdEasy一1在BJS 1 83细菌内进行同源重组。抽提质粒，行电泳和Pacl酶切鉴定获取正确的重组腺病毒质粒PAdEasy-VEGFP一CDglyTKo三、293细胞包装、扩增重组腺病毒 用经Pacl酶切线性化的重组腺病毒质粒pAdEasy一vEJP一eDg一yTK，按LIPo化e认M取EZ000产品说明书转染293细胞，通过荧光显微镜观察GFP的表达情况。转染后第1 4d收集细胞，反复冻融（一7oaC，一树37oC，3mi可振荡，lmin）4次收集病毒上清。取一/2病毒上清感染293细胞，5d后收集细胞，以相同的冻融法收集病毒上清。如此反复取病毒上清感染293细胞进行大量扩增（共4次），收集病毒上清。行氯化艳密度梯度离心法纯化并用紫外分光光度计测定重组腺病毒滴度。四、腺病毒介导的vEGF启动子一cDglyTK融合基因系统对Lovo?