肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是临床中常见的高发性、高致死率恶性肿瘤。由于缺少可靠且特异性的早期诊断生物标识物,HCC患者确诊时多为晚期,术后五年生存率不足5%。流行病学表明,乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是诱发HCC的主要因素。作为HBV感染高发地区,我国由HBV诱发的HCC居世界第一。乙肝病毒x蛋白(HepatitisBvirusxprotein,HBx)作为HBV复制过程中的多功能病毒蛋白,通过蛋白-蛋白相互作用,在影响细胞内信号通路、转录活性因子中起关键性作用。虽然HCC患者血清中可检测到HBx蛋白,但由于该蛋白自身半衰期短,仍不能有效预警和跟踪HBV诱发HCC的病理进程。寻找由HBV诱发HCC的体内特异性生物学指标对早期诊断及预防HCC的发生具有十分重要的临床意义。细胞色素CYP450代谢酶(CytochromeP450s,CYP450)作为机体维持自身稳态,清除外源化学致癌物的关键酶系,是实现机体自身保护和应激防御的重要屏障。CYP3A4是CYP450家族中的主要亚型,参与了近50%外源物质和30%内源物质的代谢过程。在肝脏首过效应中,CYP3A4可将药物代谢成为活性更强的代谢产物,也可使药物的药理作用减弱或消失,同时,大多数代谢产物由于极性变化而使其易于排出体外而解毒。因此,CYP3A4在肝脏中的蛋白表达水平、代谢活性不仅影响药物的疗效与毒性,也是保护机体和维持体内稳态的关键元素。CYP3A4的基因及蛋白表达水平以及其代谢活性均受肝脏功能与相关疾病的影响。非酒精性脂肪肝(Non-alcoholicfattyliverdisease,NAFLD)、肝硬化(Hepaticcirrhosis)的发生均影响CYP3A4的代谢功能,HCC的发生亦与其功能变化密切相关。在HBV诱发的HCC中,CYP3A4的基因转录可受三个方面的影响:1)表观遗传学的改变,如CYP3A4启动子区域的DNA甲基化可直接影响CYP3A4的核内转录过程,CYP3A4转录激活相关蛋白的组氨酸乙酰基化、甲基化、泛素化水平亦可有效调控CYP3A4的基因转录过程。2)HBx蛋白可直接作用于某些转录因子如抑癌基因p53,腺苷反应元件结合蛋白(cAMPresponseelement-bindingprotein,CREB)等,从而间接激活或抑制CYP3A4的基因转录活性。HBx亦可激活核转录因子NF-κB,直接影响CYP3A4基因转录的核受体调控通路。3)HBx通过激活转录激活因子间接调控核受体通路介导的CYP3A4转录激活过程,HBx亦可直接作用于核受体孕烷X受体(PregnaneXreceptor,PXR)及同型配合体视黄醇X受体(RetinoidXReceptorα,RXRα)的复合体,使PXR调控CYP3A4基因转录受阻。但HBV诱发HCC最终导致CYP3A4功能改变的机理至今尚未清晰阐明,同时,HBx-PXR/RXRα-CYP3A4三者间的相互关系及作用机理亦未清晰阐明。鉴于HBV诱发HCC在中国的高发性,同时,CYP3A4在维持机体稳态中的重要性以及与HCC发生的密切性,本文旨在系统阐明在HBV诱发HCC过程中CYP3A4的代谢活性、基因及蛋白表达水平的变化及其相关分子机制,将重点研究HBx蛋白对CYP3A4基因转录的影响及机制,以期揭示CYP3A4可作为诊断或早期预警HBV诱发HCC时关键生物学指标的可能性及其理论依据。同时,亦为HCC治疗药物的选择提供理论指导。因此,本文采用HCC临床离体组织样本、肝癌细胞、正常肝细胞为研究对象,分别采用细胞转染、凝胶迁移、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀以及其他分子生物学实验方法与技术,研究HBx蛋白对CYP3A4基因转录的影响及其分子机制。其主要方法和结果如下。1、由HBV诱发的HCC临床组织样本中CYP3A4的功能变化研究经南方医院医学伦理委员会批准,采集了十例中低分化HCC患者的肿瘤及癌旁正常组织样本,并制备石蜡组织切片观察样本的病理学变化。将采集的组织样本制备成肝微粒体(Microsomes),采用底物(睾丸酮)探针法,经UPLC测定底物被CYP3A4代谢的活性变化。采用荧光实时定量PCR(Realtime-PCR)及蛋白质印迹法(Westernblotting)分别对临床组织样本中CYP3A4的mRNA及蛋白表达水平进行检测。病理结果显示,肿瘤组织中并无大面积坏死,十例患者均为中低分化的肝癌患者。CYP3A4的酶代动力学结果显示,商品化人正常肝微粒体对睾丸酮的酶动力学参数Vmax为2512pmol/mgprotein/min,Km为44.88μM;癌旁正常组织肝微粒体对睾丸酮的酶动力学参数Vmax为2162pmol/mgprotein/min,Km为64.13μM;肿瘤组织肝微粒体对睾丸酮的酶动力学参数Vmax为81.40pmol/mgprotein/min,Km为26.77μM。PCR结果显示,肿瘤组织中CYP3A4的mRNA表达水平均显著降低。Westernblottinng结果显示,在肿瘤组织中,除P1、P4病例样本外,其余8例样本CYP3A4的蛋白表达水平亦显著下降。以上结果表明,HCC的发生能引起CYP3A4代谢活性的下降,其直接原因可能与HCC组织中显著降低的CYP3A4蛋白及基因表达水平相关,其机制可能与CYP3A4基因转录过程受阻有关。2、由HBV诱发的HCC临床组织样本中相关转录细胞因子(NF-κB、p53、CREB),核受体通路(PXR、RXRα、GR)及HBx的蛋白及基因表达水平。提取上述十例临床组织样本mRNA及组织核蛋白。采用PCR及Westernblottinng检测相关转录细胞因子NF-κB(phospho-p65)、phospho-p53、phospho-CREB,核受体通路关键蛋白PXR、RXRα、糖皮质激素受体(Glucocorticoidreccptor,GR)以及HBx的基因及蛋白表达水平。基因转录激活及抑制相关因子NF-κB(phospho-p65)、phospho-p53在十例肿瘤和癌旁正常组织中的平均蛋白表达水平无显著性差异,且十例病例的肿瘤组织和癌旁正常组织中上述蛋白的表达水平亦存在相反趋势。虽然肝细胞癌组织中phospho-CREB的核内蛋白表达水平显著升高(P