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第一部分:肺腺癌患者肿瘤组织和癌旁组织中巨噬细胞及PD-1的表达差异性研究目的:通过分析肺腺癌患者术后腺癌肿瘤组织及癌旁组织中CD8+T淋巴细胞PD-1表达以及巨噬细胞浸润情况,探究肺腺癌患者腺癌肿瘤微环境中免疫抑制特征,为患者病理发展过程及预后提供指导。方法:收集115例初治肺腺癌患者的肿瘤病理组织及癌旁组织标本;采用免疫荧光双染法分别进行PD-1/CD8染色以及CD86/CD204染色,充分评估T细胞免疫检查点PD-1以及M1巨噬细胞（CD86+CD204-）、M2型巨噬细胞（CD86-CD204+）的比例分布及不同病理组织中差异性别表达;探讨PD-1表达水平及巨噬细胞表型与肺腺癌患者年龄、肿瘤分期、临床亚型及预后的关联性;同时分析肿瘤组织中PD-1表达与M2型巨噬细胞关联性。结果:肺腺癌肿瘤组织中CD8+PD-1+T淋巴细胞和M2型巨噬细胞表达高于癌旁组织（P＜0.05）,而M1型巨噬细胞在肿瘤组织中的表达明显的低于癌旁组织（P＜0.05）;肿瘤组织中PD-1和M2型巨噬细胞的表达水平与TNM分期有关（P＜0.05）,与患者年龄、性别及肿瘤亚型无关,且PD-1和M2型巨噬细胞在肿瘤组织中表达水平呈正相关;肿瘤组织中PD-1和M2型巨噬细胞的表达水平与患者预后呈负相关。结论:CD8+PD-1+T淋巴细胞和M2型巨噬细胞在肺腺癌肿瘤组织中高表达,PD-1表达与M2型巨噬细胞的浸润程度与肺腺癌患者TNM分期呈正相关;PD-1表达与M2型巨噬细胞的浸润程度呈现正相关性;PD-1的高表达及M2型巨噬细胞的高浸润特性与患者远期预后不良具有关联性。第二部分:PD-1/B7H1信号通路调控巨噬细胞表型及功能研究目的:探究PD-1/B7H1信号通路调控巨噬细胞表型及功能的影响,为临床进行肺腺癌患者免疫抑制研究提供启发,为肺腺癌的综合治疗提供新的思路。方法:选取人源性巨噬细胞THP-1作为研究对象,进行原代培养,选择第三代单层细胞作为研究对象。构建PD-1mimics、PD-1inhibitor及B7H1 inhibitor慢病毒质粒载体,分别转染到上述THP-1细胞内,设置如下分组,Control组（THP-1不做任何处理）、PD-1mimics组（细胞内转染PD-1mimics）、PD-1inhibitor组（细胞内转染PD-1inhibitor）、PD-1-B7H1 inhibitor组（细胞内转染PD-1inhibitor+B7H1 inhibitor）。将上述各组THP-1细胞与A549细胞系进行分层共培养72小时后进行相关项目检测分析。PD-1与B7H1靶向调控关系验证;THP-1形态学分析;RT-PCR检测各组细胞PD-1及B7H1的mRNA表达分析;流式细胞术检测各组巨噬细胞纯度分析;ELISA检测各组巨噬细胞中细胞炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α及IL-12浓度表达;RT-PCR/Western-blot检测各组巨噬细胞中CD86、CD204表达水平分析;检测各组巨噬细胞细胞吞噬率。收集上述与巨噬细胞共培养后的各组A549细胞,采用划痕实验及Transwell实验检测各组肿瘤细胞的迁移和侵袭能力;采用Western-blot检测各组细胞侵袭相关蛋白MMP-2及MMP-9浓度表达。结果:1)PD-1靶向B7H1鉴定分析:PD-1与B7H1 mRNA 3’非编码区预测到一个结合位点;应用共转染技术将不同组合的野生型和突变型p GL3-B7H1Y-UTR表达载体转染到THP-1细胞中,结果表明共转染野生型表达载体报告基因活性相对于对照组显著升高（P＜0.05）。2)巨噬细胞形态分析:THP-1细胞长势良好,出现M1及M2混合培养状态,在与A549共培养下,巨噬细胞的形态发生变化。3)RT-PCR/Western-blot检测PD-1、B7H1基因mRNA表达:PD-1分析各组表达趋势为PD-1-B7H1 inhibitor＜PD-1inhibitor＜Control＜PD-1 imimcs（P＜0.05）;B7H1分析趋势为PD-1-B7H1inhibitor＜PD-1 inhibitor＜Control＜PD-1 mimics（P＜0.05）。4)流式细胞术检测和Western-blot检测分析检测各组细胞中CD86、CD204表达:CD86的数据分析为PD-1 mimics＜Control＜PD-1 inhibitor＜PD-1-B7H1 inhibitor（P＜0.05）,CD204的数据分析为PD-1-B7H1 inhibitor＜PD-1 inhibitor＜Control＜PD-1 mimics（P＜0.05）;5)ELISA检测各组THP-1炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α及IL-12浓度:促炎性因子IL-6、TNF-α及IL-12浓度表达体现出相同的变化趋势,各组数据比较趋势为PD-1 mimics＜Control＜PD-1 inhibitor＜PD-1-B7H1 inhibitor（P＜0.05）;抑炎性因子IL-10则体现出相反的趋势,趋势为PD-1-B7H1 inhibitor＜PD-1inhibitor＜Control＜PD-1 mimics（P＜0.05）。6)共培养后巨噬细胞吞噬率检测:各组巨噬细胞的吞噬率趋势比较为PD-1 mimics＜Control＜PD-1inhibitor＜PD-1-B7H1 inhibitor（P＜0.05）。7)A549细胞细胞迁移及侵袭能力分析:各组A549细胞的迁移率/侵袭性比较趋势为PD-1-B7H1 inhibitor＜PD-1inhibitor＜Control＜PD-1 mimics（P＜0.05）;在MMP-2及MMP-9蛋白浓度在各组数据表达趋势为PD-1-B7H1 inhibitor＜PD-1 inhibitor＜＜Control＜PD-1 mimics（P＜0.05）。结论:PD-1靶向B7H1信号通路对巨噬细胞的表型进行调控,当PD-1过表达时,B7H1表达增加,M2型巨噬细胞比例增加,细胞的抑炎性因子浓度表达提升,吞噬细胞的吞噬能力下降,促进肿瘤组织的病理性发展;当PD-1沉默后,体现出相反趋势。PD-1通过巨噬细胞表型变化进而对A549细胞的迁移及侵袭性作出调控,当PD-1过表达时,M2型巨噬细胞比例增加,肿瘤细胞的迁移及侵袭增强,促进肿瘤的发生和发展。