近年来,Akkermansia muciniphila作为新型热点功能性人体肠道共生菌受到广泛关注。大量研究表明,该菌在肠道内定殖丰度与机体代谢疾病和免疫疾病相关,因此,保持肠道内A.muciniphila丰度适宜对人体健康而言至关重要。众所周知,食物是与肠道微生物发生最频繁直接接触的外源因素,肠道微生物在肠道中的定殖、生长和代谢不可避免地要受到饮食的影响。不同食物其蛋白质和寡糖链的种类、组成和含量各不相同,对肠道微生物的影响也不同,因此推测不同食物营养组份对肠道中的功能菌A.muciniphila的生长代谢也有不同的影响。然而迄今为止,关于影响A.muciniphila丰度的食源性因素研究不多,研究方向多局限于非常规可食用物质,对于常规饮食对该菌的影响及其机理尚未见报道。目前可以确定黏蛋白是A.muciniphila唯一天然营养物质。探究A.muciniphila对黏蛋白的利用方式将是开展关于食物影响该菌丰度的研究所需要迈出的第一步。根据A.muciniphila蛋白组学和基因组学研究结果可以推测该菌具有分解黏蛋白寡糖链为单糖并加以利用的能力。黏蛋白中的O-型寡糖链占黏蛋白总分子量的80%,但黏蛋白O-型寡糖链与A.muciniphila生长相关性仍然缺少直接实验依据。针对上述问题,本文以猪肠胃黏蛋白为研究对象,在了解其糖链结构的基础上进一步研究黏蛋白O-糖链如何影响A.muciniphila生长。具体研究内容如下:1.猪肠胃黏蛋白的结构分析通过β-消除法提取猪肠胃黏蛋白O-糖链,利用HPLC技术分析O-糖链结构。根据HPLC结果可知:该黏蛋白O-型寡糖链的起始糖均为GalNAc,糖链结构类型多以Core 1和Core 2形式存在,在核心结构基础上糖链以Gal和GlcNAc进行延伸,Gal和GlcNAc多交替出现,糖链末端存在唾液酸修饰和岩藻糖基化修饰,并且糖链结构键型复杂。利用酸水解法分析猪肠胃黏蛋白单糖组分和猪肠胃黏蛋白O-糖链单糖组分,利用HPLC分析水解后的单糖产物。可以确定该黏蛋白单糖组分及含量为:Gal＞GlcNAc＞GalNAc＞Glc＞Fuc＞GalA＞GlcA＞Neu5Ac。而该黏蛋白O-糖链单糖组分中不含有GlcA,其他组分与黏蛋白单糖组分一致,除了 Gal和Fuc含量几乎不变以外,其他几种单糖含量都下降。2.猪肠胃黏蛋白单糖组分中影响Akkermansia muciniphila生长的主效因子研究确定该黏蛋白单糖组分后,将A.muciniphla菌液添加到含有不同浓度单糖溶液的BHI培养基中,通过测定A.muciniphila生长曲线判定每种单糖对其生长的影响。实验结果表明,其中Gal对该菌的促生长效果最明显。而Neu5Ac可以抑制A.muciniphila生长。同时,以 pNP-β-Gal、pNP-α-Glc、pNP-β-GalNAc、pNP-β-GlcNAc、pNP-β-Fuc、X-Gal-Neu5Ac作为反应底物检测A.muciniphila外切糖苷酶活性。综合考虑胞内酶和胞外酶活性时,A.muciniphila半乳糖苷酶活性最好。因为黏蛋白单糖组分中Gal含量最高、Gal对A.muciniphila生长促进效果最明显和A.muciniphila外切半乳糖苷酶活性最强,可以判断Gal是促进该菌生长的单糖主效因子。最后,本实验通过将Gal和BSA加入到无氮源、碳源的基础培养基中初步分析糖类和蛋白质在A.muciniphila生长过程中的必要性,根据实验结果初步判断该菌在只糖类物质作为营养物质的时候不能正常生长,.需要培养集中同时含有蛋白质。3.猪肠胃黏蛋白O-糖基化修饰对Akkermansia muciniphila生长的影响本章利用表达纯化后的N-乙酰氨基半乳糖苷酶Tn2105、N-乙酰氨基己糖苷酶Am2301、唾液酸糖苷酶Am0707、半乳糖苷酶Am0874以及商业岩藻糖苷酶和商业半乳糖苷酶水解猪肠胃黏蛋白。通过HPLC检测水解后的单糖产物,发现黏蛋白经过糖苷酶水解后可以得到对应单糖色谱峰,说明糖苷酶可以成功水解黏蛋白糖链。为了验证水解反应是否彻底,本实验利用HPLC分析黏蛋白经过酶切后残余的O-糖链和单糖,结果显示几乎没有残留O-糖链和单糖,说明在多种糖苷酶共同作用下可以完全水解黏蛋白O-糖链,从而得到非糖基化黏蛋白。在此基础上,将黏蛋白经过酶切后得到的糖类物质、去糖基化黏蛋白以及两者混合物分别加入到含有A.muciniphila菌液的无碳源、氮源培养基中。根据A.muciniphila生长曲线结果可知,该菌在只含有糖类物质的培养基中几乎不生长;但是在只含有去糖基化黏蛋白的培养基中可以缓慢生长;两者共同存在时该菌生长速率显著提升,且接近等量黏蛋白对该菌的生长促进效果。说明黏蛋白O-糖链在A.muciniphila生长过程中发挥重要促进作用。