论文部分内容阅读
背景:造血是一个精细的调控过程,能使骨髓中不成熟的祖细胞最终分化成熟进入外周血。外周血中成熟的血细胞如中性粒细胞的生存期较短,以严格地调控其在外周血的正常数量。这就需要造血祖细胞适度的增殖、分化成熟或发生凋亡造血祖细胞中造血基因精细的协调以及相互作用构成了这一复杂的造血过程。慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一类由基因突变导致的造血系统恶性肿瘤,可使增殖失调、分化受阻,以及造血祖细胞生存延长。K562细胞作为一株分化程度差、恶性程度高的细胞系,在合适的诱导条件下可以向红系、粒系和巨核系多个方向分化。CIAPIN1(cytokine-induced apoptosis inhibitor1)是一个新近被证实和凋亡相关的因子,是独立于凋亡调节分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信号转导通路中的一个新调节分子。研究表明CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切关系,目前CIAPIN1基因在慢性粒细胞白血病中的作用尚未见报道。目的:探讨靶向干扰CIAPIN1基因对K562细胞粒系分化的影响,并研究其相关机制,为慢性粒细胞白血病的治疗提供新的靶点。方法:采用RNA干扰技术沉默K562细胞内的CIAPIN1基因,瑞氏染色和电镜观测细胞形态和超微结构的变化,实时定量PCR和流式细胞术检测粒系分化标志基因的变化;采用western blotting技术检测沉默CIAPIN1基因后NHE1表达的变化,进一步改变NHE1表达或活性,研究NHE1在K562细胞粒系分化中的作用及CIAPIN1与NHE1之间的调控关系;采用western blotting技术检测NHE1表达改变对ERK1/2磷酸化的影响,进一步改变ERK1/2活性,研究ERK1/2信号通路在K562细胞粒系分化中的作用及NHE1与ERK1/2之间的调控关系。结果:沉默CIAPIN1基因能促进K562细胞向成熟的粒细胞阶段分化;CIAPIN1基因表达下调引起NHE1表达降低和磷酸化ERK1/2表达升高;沉默CIAPIN1基因后,干扰NHE1表达或降低其活性进一步促进CIAPIN1下调引起的K562细胞分化,过表达NHE1则逆转该分化过程;沉默CIAPIN1基因后,干扰或过表达NHE1分别引起磷酸化ERK1/2升高和降低,进一步抑制ERK1/2活性则逆转NHE1下调或活性降低引起的K562细胞分化。结论:沉默CIAPIN1基因能促进K562细胞的粒系分化,CIAPIN1可直接靶向NHE1,通过下调NHE1引起K562细胞粒系分化,ERK1/2信号通路参与了该分化过程。CIAPIN1和NHE1可能成为慢性粒细胞白血病的潜在治疗靶点。背景:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,费城染色体(P11)和bcr-abl融合基因的形成在其发病中发挥了关键作用。伊马替尼为bcr-abl信号传递系统抑制剂,是慢性粒细胞白血病特异性的分子靶向药物。虽然伊马替尼对慢性粒细胞白血病患者尤其是慢性期患者具有很好的疗效,但伴随应用的积累和疾病的进展,仍然不可避免会出现伊马替尼耐药现象。为此,寻找不依赖bcr-abl激酶的新的有效治疗靶点有望解决这一耐药问题。CIAPIN1(cytokine induced apoptosis inhibitor1)是一个新近被证实和凋亡相关的因子,是独立于凋亡调节分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的RAS信号转导通路中的一个新的调节分子。研究表明CIAPIN1基因的表达与肿瘤的发生发展有密切关系,但目前CIAPIN1基因在慢性粒细胞白血病中的作用尚未见报道。伊马替尼通过抑制bcr-abl阳性细胞增殖,促进细胞凋亡来发挥作用,CIAPIN1作为一凋亡相关因子,是否在慢性粒细胞白血病细胞对伊马替尼敏感性中发挥了作用,需要进一步研究探索。目的:以慢性粒细胞白血病细胞系K562为研究对象,探究CIAPIN1基因在K562细胞对伊马替尼敏感性中的作用及相关机制。方法:1、对2011年8月~2012年8月本院收治的14例成人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)患者,20例急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者,37例慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)患者及16例慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)患者骨髓标本进行研究,并收集8例正常供者骨髓标本为对照。分离单个核细胞,应用实时定量PCR方法检测骨髓单个核细胞中CIAPIN1基因的表达水平。2、利用RNA干扰技术,构建靶向CIAPIN1基因的特异性干扰载体,稳定转染K562细胞。利用MTT实验检测K562细胞体外增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞体外克隆形成能力,流式细胞技术检测细胞周期,Hoechst33258染色及Annexin V-APC/PI双染检测细胞凋亡,BALB/C裸鼠体内成瘤实验检测细胞裸鼠体内成瘤性。3、伊马替尼同时处理转染了空载体和CIAPIN1干扰载体的K562细胞。利用MTT实验检测K562细胞体外增殖活性,细胞集落形成实验检测细胞体外克隆形成能力,流式细胞技术检测细胞周期,Hoechst33258染色及AnnexinV-APC/PI双染检测细胞凋亡。4、应用western blotting技术检测Bcl-2和caspase家族凋亡相关蛋白的表达,检测耐药相关蛋白Pgp的表达,检测NF-κB信号通路相关蛋白IKKα、IKKβ、IκBα的表达及磷酸化IKKα/β、磷酸化IκBα的表达;免疫荧光技术观察K562细胞内NF-κB p65的核定位。结果:1、CIAPIN1基因在CML患者骨髓单个核细胞及CML细胞系K562中的表达明显高于正常对照组(P<0.05)。2、成功构建了CIAPIN1稳定干扰的K562细胞系。体外实验表明:沉默CIAPIN1基因降低了K562细胞的增殖活性,抑制了细胞的克隆形成能力,将细胞周期阻滞在G1/S期,对细胞凋亡未见影响。体内实验表明:沉默CIAPIN1基因抑制了K562细胞在BALB/C裸鼠体内的成瘤性。3、伊马替尼处理后,沉默CIAPIN1基因降低了K562细胞的增殖活性,抑制了细胞的克隆形成能力,将细胞周期阻滞在Gl/S期,促进了细胞凋亡。4、伊马替尼处理后,沉默CIAPIN1基因上调了Bid、Bim及cleaved PARP的表达,激活了caspase,下调了Bcl-xl、Bcl-2及Mcl-1的表达;沉默CIAPIN1基因下调了PgP的表达,CIAPIN1与PgP的表达存在正相关性;沉默CIAPIN1后,K562细胞中IKKα/β和IκBα蛋白的磷酸化水平降低,NF-κB的核内定位明显减少,当CIAPIN1沉默的K562细胞经NF-κB特异性抑制剂Bay11-7082(IκB磷酸化抑制剂)处理后,IKKα/β和IκBα的磷酸化水平进一步降低,NF-κB在细胞核内的定位进一步减少,表明NF-κB信号通路活性进一步降低。结论:CIAPIN1表达下调提高了K562细胞对伊马替尼的敏感性,且至少是通过对Bcl-2、caspase家族及Pgp的调节来实现的;NF-κB信号通路在CIAPIN1介导的K562细胞对伊马替尼敏感性中发挥了重要作用。背景:乳腺癌是女性恶性肿瘤中最常见的一种,肿瘤细胞的转移是乳腺癌患者治疗失败和死亡的主要原因,因此深入研究乳腺癌转移的机制无疑是需要迫切解决的一大难题。CIAPIN1是近年来通过克隆表达方法鉴定的一个新的凋亡抑制分子,被证实与多种恶性肿瘤密切相关,而在乳腺癌转移中的作用尚未见报道。钠氢交换蛋白1(Na+/H+exchanger1, NHE1)是在哺乳动物中广泛表达的一种整合膜蛋白,可以促进细胞内的H+和细胞外的Na+交换,从而维持细胞内碱化和细胞外环境酸化的稳态,而这种细胞内外酸碱稳态对于肿瘤的发生、发展至关重要。大量研究已经证实NHE1参与了许多实体瘤的转移,其中包括乳腺癌,但是其详细作用机制尚不清楚。目的:以乳腺癌细胞MDA-MB-231为研究对象,探讨CIAPIN1在其转移中的生物学作用及相关机制,并在此基础上初步阐明CIAPIN1和NHE1之间的调控机制,为寻找乳腺癌新的治疗策略提供理论依据。方法:1、采用实时定量PCR和western blotting技术检测CIAPIN1在侵袭能力不同的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7中的表达差异;2、构建CIAPIN1的慢病毒表达载体感染MDA-MB-231细胞,采用划痕实验和transwell实验研究CIAPIN1在MDA-MB-231细胞体外转移中的作用;3、采用实时定量PCR和western blotting技术检测过表达CIAPIN1后NHE1表达的变化,改变NHE1活性,研究NHE1在MDA-MB-231细胞体外转移中的作用及CIAPIN1与NHE1之间的调控关系;4、采用western blotting技术检测过表达CIAPIN1后改变NHE1活性对磷酸化ERK1/2表达的影响,采用ERK1/2信号通路抑制剂PD98059研究其在MDA-MB-231细胞体外转移中的作用及NHE1与ERK1/2之间的调控关系;5、采用western blotting技术检测过表达CIAPIN1后、抑制NHE1活性或/和磷酸化ERK1/2后基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达变化。结果:1、CIAPIN1在MDA-MB-231细胞中的表达低于其在MCF-中的表达;2、过表达CIAPIN1能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭,下调MMP2和MMP9的表达;3、过表达CIAPIN1引起NHE1和磷酸化ERK1/2表达降低;4、过表达CIAPIN1后,抑制NHE1活性进一步抑制MDA-MB-231细胞的体外转移,进一步下调MMP2和MMP9的表达;5、过表达CIAPIN1后,抑制NHE1活性能显著降低ERK1/2的磷酸化水平,同时抑制NHE1活性和ERK1/2磷酸化进一步抑制MDA-MB-231细胞的体外转移,进一步下调了MMP2和MMP9的表达。结论:过表达CIAPIN1能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭。CIAPIN1可直接靶向NHE1,通过下调NHE1抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭,ERK1/2信号通路参与了该过程。CIAPIN1和NHE1是乳腺癌潜在的治疗靶点。