非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代谢综合征的主要肝脏表现,它代表了广泛的组织病理学异常,从简单的非酒精性脂肪肝(NAFL)到非酒精性脂肪性肝炎(NASH),有或没有纤维化,最终会发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC).NAFLD与肝脏脂肪增加和全身胰岛素抵抗(IR)有关,提示常见的致病机制,但是具体的机制及其代谢改变目前尚不清楚.近年来,NAFLD患病率在全球范围内呈上升趋势.在非酒精性脂肪肝病发展过程中,线粒体功能的改变被认为发挥着极其重要的作用.然而,一方面有不同的研究认为这一作用被高估;另一方面,肝脏线粒体功能如何改变及其改变的内在机制尚不清楚.因此,在本课题中我们用DBA/2J、C57BL/6J两种不同品系的小鼠,在给予三种不同的饮食(HFD高脂饮食模型、HFCS高脂高糖高胆固醇饮食模型、MCD蛋氨酸-胆碱缺乏饮食模型)构建NAFLD模型中观察NAFLD发展过程中线粒体功能的变化及其相关的机制.为了观察NAFLD发展过程中线粒体呼吸功能的变化,我们采用高分辨率呼吸测量法来检测NAFLD小鼠肝脏线粒体的呼吸变化情况,我们发现,不同品系的小鼠和不同饮食处理方式会导致不同的线粒体呼吸功能的影响,但总体来说,能量应激情况下NAFLD发展过程中,小鼠肝脏线粒体呼吸功能会降低;而MCD饮食情况并不会造成NAFLD小鼠肝脏线粒体呼吸功能的显著影响.为了探究在NAFLD发展过程中影响小鼠肝脏线粒体呼吸功能的因素或其发生的相关代偿效应,我们从呼吸链复合体含量和活性、氧化应激、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数、mtDNA翻译、分子水平质量控制蛋白和细胞器水平质量控制蛋白等多个方面进行了进一步研究.
　　目的:
　　1.根据文献报道,不同品系小鼠以及不同饮食下发生的NAFLD存在不同的影响和机制,为了观察不同品系及不同饮食下发生的NAFLD对小鼠线粒体功能的影响,我们采用了两种品系的小鼠以及三种不同的饮食模型来观察NAFLD发展过程中线粒体功能的变化以及相关机制.
　　2.为了观察不同品系以及不同饮食模型下NAFLD发展的不同过程中,其肝脏线粒体功能的改变,我们对各组不同阶段的小鼠肝脏线粒体进行了氧耗量的检测,以此来评价其肝脏线粒体的呼吸功能.
　　3.为了观察NAFLD小鼠肝脏线粒体呼吸功能的下降是否与呼吸链复合体含量、活性以及质量的改变有关,我们对各组肝脏线粒体进行了OXPHOS复合体含量、活性及其质量的分析.
　　4.由于营养应激本身是导致线粒体氧化应激的一个重要因素,为了观察营养应激过程中NAFLD小鼠氧化应激的变化,我们对各组小鼠肝脏的蛋白氧化损伤水平进行了检测.
　　5.为了进一步说明在小鼠NAFLD发展过程中,肝脏线粒体功能的变化,我们检测了线粒体DNA拷贝数以及线粒体基因的表达来观察线粒体数目的变化.
　　6.为了分析在NAFLD发展过程中影响线粒体呼吸功能的其他代偿机制,我们对分子水平线粒体的质量控制蛋白进行了分析.
　　7.因为线粒体的分裂与融合,甚至自噬与线粒体功能密切相关,因此我们通过观察一些相关指标来进一步观察线粒体分裂融合和自噬水平的一些变化.
　　方法:
　　1.为了构建NAFLD小鼠模型,根据文献报道,我们选取了较常用的三种不同饮食进行喂养,第一种为单纯60%高脂饮食喂养12周,即HFD;第二种为45%高脂加1%胆固醇,配合含42g/L葡萄糖和果糖的饮水喂养12周,即HFCS;第三种为用蛋氨酸-胆碱缺乏饲料喂养8周,即MCD.
　　2.为了观察NAFLD发展过程中,小鼠葡萄糖耐受情况,我们对小鼠腹腔注射葡萄糖来进行葡萄糖耐量试验.
　　3.运用HE染色技术和油红O染色技术,观察不同阶段小鼠肝脏结构变化情况以及脂质堆积情况.
　　4.取小鼠肝组织,提取肝脏线粒体,用O2K线粒体功能检测仪检测小鼠肝脏线粒体氧耗水平,以评价NAFLD发展过程中肝脏线粒体的呼吸功能.
　　5.通过BN-PAGE技术,检测NAFLD发展过程中,小鼠肝脏线粒体OXPHOS复合体含量的变化情况;通过胶内酶活性分析技术,观察在非酒精性脂肪肝病发展过程中,小鼠肝脏线粒体OXPHOS复合体活性及其质量的改变情况,以此共同来评价NAFLD小鼠肝脏OXPHOS水平.
　　6.通过蛋白氧化损伤检测技术来评价在NAFLD发展过程中肝脏线粒体蛋白氧化应激能力的水平.
　　7.通过QPCR检测小鼠肝脏线粒体DNA拷贝数的变化,以此来观察小鼠肝脏线粒体数目的变化.
　　8.通过glycine-SDS-PAGE电泳分析mtDNA翻译水平、分子水平质量控制蛋白、细胞器水平质量控制蛋白的变化,以观察在NAFLD发展过程中的相关代偿机制.
　　结果:
　　1.在给予高脂饮食喂养过程中,在高脂喂养初始阶段,DBA/2J小鼠体重增长较快,C57BL/6小鼠体重增长较缓慢,但在HFD饮食后期,C57BL/6J小鼠体重增长较快,而DBA/2J体重增长趋于平缓.给予MCD饮食随着喂养时间的延长,小鼠体重会逐渐减轻.
　　2.给予HFD高脂饮食和HFCS饮食构建非酒精性脂肪肝病小鼠模型过程中,均能造成小鼠葡萄糖耐受性受损,且两种不同的饮食模型均能引起不同品系的小鼠发生非酒精性脂肪肝损害.MCD饮食喂养8周后能引起较好的非酒精性脂肪肝损害的小鼠模型.
　　3.从测定肝脏线粒体氧耗量的实验中可发现,DBA/2J随着HFD高脂喂养,线粒体功能逐步受到影响,而C57BL/6J小鼠随着HFD高脂的喂养,刚开始线粒体功能下降较明显,但这种损害并没有随着高脂时间的延长而加重.C57BL/6J小鼠在HFCS喂养过程中线粒体功能也在逐步受到影响;MCD饮食小鼠线粒体呼吸功能并未有显著变化.
　　4.从氧耗实验还可以发现,不同模型下线粒体呼吸偶联的变化情况存在一定的差异,DBA/2J在HFD过程中偶联呼吸下降显著,非偶联呼吸上升明显;C57BL/6J小鼠给予HFD饮食时非偶联呼吸没有受到显著影响,而在给予HFCS饮食时非偶联呼吸能力得到一定程度的提升.
　　5.从BNG结果可发现,C57BL/6J和DBA/2J小鼠在高脂相关饮食过程中呼吸链超级复合体和未组装到超级复合体的单体含量未见显著差异,少部分营养应激小鼠可能还存在超级复合体代偿性上升的趋势,但与喂养时间和强度并未发现任何相关性;MCD肝纤维化小鼠肝脏呼吸链超级复合体和单体有显著下降.
　　6.通过检测小鼠肝脏线粒体呼吸链复合体活性,我们发现,两种品系小鼠无论在何种饮食处理下,其肝脏线粒体呼吸链复合体活性并未有显著下降;在MCD小鼠模型中,矫正BNG超级复合体酶含量后,我们发现无论是超级复合体CⅠn+Ⅲn还是CⅠn+Ⅲn+Ⅳn的单位酶活性均有显著升高.
　　7.通过蛋白氧化损伤分析,我们发现营养应激小鼠中,肝脏线粒体蛋白的氧化应激并没有升高,反而在不少营养应激小鼠中出现了下降的趋势;MCD肝纤维化小鼠肝脏线粒体蛋白氧化应激水平显著下降.
　　8.通过线粒体DNA拷贝数实验,三组营养应激小鼠均存在肝脏mtDNA拷贝数先下降后上升的趋势;MCD小鼠mtDNA拷贝数显著下降.通过对线粒体基因编码的两个蛋白MTCOI、COX2进行分析,我们发现mtDNA编码蛋白的翻译水平在营养应激小鼠和MCD小鼠中均未显著增加.
　　9.通过对分子水平质量控制蛋白分析,我们发现营养应激小鼠质量控制蛋白的表达在营养应激的强度和时间上未出现显著上升,反而在某些过程中出现了下降的情况;而MCD小鼠存在显著的分子水平质量控制蛋白表达的变化.
　　10.通过对细胞器水平质量控制蛋白分析,我们发现在NAFLD发展过程中,肝脏线粒体的分裂融合存在显著的变化,但并未有规律性;自噬水平并未有显著改变.
　　结论:
　　1.不同品系的小鼠在给予HFD、HFCS以及MCD饮食时,均能构建出较理想的NAFLD模型.
　　2.在给予HFD、HFCS营养应激的过程中,会造成小鼠葡萄糖耐受性受损.
　　3.不同小鼠品系,不同的饮食模型,无论何种处理方式,高脂相关喂养均能造成小鼠肝组织线粒体呼吸功能下降;而非营养应激的肝纤维化模型肝脏线粒体呼吸功能并未显著改变.
　　4.通过肝脏线粒体呼吸链复合体含量和活性分析的结果表明,营养应激过程中,肝脏线粒体呼吸功能的下降并不由呼吸链复合体含量和活性改变导致;MCD小鼠可能存在显著的OXPHOS功能代偿,也就是说MCD小鼠线粒体OXPHOS的质量高于正常饮食小鼠.
　　5.在NAFLD发展过程中,肝脏线粒体可能存在高度激活的抗氧化应激能力,以抵抗线粒体的氧化损伤.
　　6.营养应激小鼠可能存在一定程度肝脏线粒体功能代偿,我们发现mtDNA拷贝数有上升的趋势,但是mtDNA编码的蛋白并没有差异,因此mtDNA拷贝数的上升可能是线粒体功能的代偿,但这种代偿机制看上去比较弱,原因在于mtDNA拷贝数上升的趋势并未显著改变其所编码蛋白的含量,提示功能代偿水平较弱.
　　7.在NAFLD发展过程中,营养应激小鼠肝脏线粒体的分子水平质量控制并未出现代偿,进一步支持OXPHOS复合体在营养应激小鼠肝脏中并未有显著的组装异常或质量异常;MCD小鼠分子水平质量控制蛋白表达上升进一步支持了MCD小鼠OXPHOS复合体组装水平的显著下降.
　　8.通过对细胞器水平质量控制蛋白分析结果表明,在NAFLD发展过程中,肝脏线粒体分裂融合的稳态受到了破坏,提示线粒体功能的异常.